Grønt fluorescerende protein - Green fluorescent protein

Grønt fluorescerende protein
Struktur af Aequorea victoria green fluorescerende protein.
Identifikatorer
Symbol	GFP
Pfam	PF01353
Pfam klan	CL0069
InterPro	IPR011584
CATH	1ema
SCOP2	1ema / SCOPe / SUPFAM
Tilgængelige proteinstrukturer: Pfam   strukturer / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum strukturresumé

Det grønne fluorescerende protein ( GFP ) er et protein, der udviser lysegrøn fluorescens, når det udsættes for lys i det blå til ultraviolette område. Mærket GFP refererer traditionelt til proteinet, der først blev isoleret fra vandmanden Aequorea victoria og kaldes undertiden avGFP . Imidlertid er GFP'er fundet i andre organismer, herunder koraller , søanemoner , zoanithider , copepoder og lancetter .

GFP fra A. victoria har en stor excitationstop ved en bølgelængde på 395 nm og en mindre ved 475 nm. Dens emissionstop er ved 509 nm, som er i den nedre grønne del af det synlige spektrum . Fluorescensen kvantumudbytte (QY) af GFP er 0,79. GFP fra havets stedmoderblomst ( Renilla reniformis ) har en enkelt stor excitationstop ved 498 nm. GFP udgør et glimrende værktøj i mange former for biologi på grund af dets evne til at danne en intern kromofor uden at kræve ekstra kofaktorer , genprodukter eller andre enzymer / substrater end molekylært oxygen.

I celle- og molekylærbiologi bruges GFP -genet ofte som en reporter af ekspression . Det er blevet brugt i modificerede former til at lave biosensorer , og der er blevet skabt mange dyr, der udtrykker GFP, hvilket demonstrerer et bevis på, at et gen kan udtrykkes i en given organisme, i udvalgte organer eller i celler af interesse. GFP kan introduceres i dyr eller andre arter ved hjælp af transgene teknikker og opretholdes i deres genom og deres afkom. Til dato er GFP blevet udtrykt i mange arter, herunder bakterier, gær, svampe, fisk og pattedyr, herunder i humane celler. Forskere Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura og Martin Chalfie blev tildelt Nobelprisen i kemi 2008 den 10. oktober 2008 for deres opdagelse og udvikling af det grønne fluorescerende protein.

De fleste kommercielt tilgængelige gener til GFP og lignende fluorescerende proteiner er omkring 730 basepar lange. Det naturlige protein har 238 aminosyrer. Dens molekylmasse er 27 kD. Derfor kan fusion af GFP -genet til genet af et protein af interesse øge proteinets størrelse og molekylmasse betydeligt og kan forringe proteinets naturlige funktion eller ændre dets placering eller transportbane inden for cellen.

Baggrund

Aequorea victoria

3D-rekonstruktion af konfokal billede af VEGF-overudtrykkende neurale progenitorer (rød) og GFP-positive kontrol neurale stamceller (grøn) i rotternes olfaktoriske pære. RECA-1-positive blodkar-blå farve.

GFP af vild type (wtGFP)

I 1960'erne og 1970'erne blev GFP sammen med det separate selvlysende protein aequorin (et enzym, der katalyserer nedbrydningen af luciferin , der frigiver lys), først renset fra vandmændene Aequorea victoria og dets egenskaber undersøgt af Osamu Shimomura . I A. victoria opstår GFP -fluorescens, når aequorin interagerer med Ca ²⁺ -ioner, hvilket fremkalder en blå glød. Noget af denne selvlysende energi overføres til GFP og flytter den overordnede farve til grøn. Imidlertid begyndte dets anvendelighed som et værktøj for molekylærbiologer først at blive realiseret, før 1992, da Douglas Prasher rapporterede kloning og nukleotidsekvensen af ​​wtGFP i Gene . Finansieringen til dette projekt var løbet tør, så Prasher sendte cDNA -prøver til flere laboratorier. Martin Chalfies laboratorium udtrykte kodningssekvensen for wtGFP, med de første få aminosyrer slettet, i heterologe celler af E. coli og C. elegans , der offentliggjorde resultaterne i Science i 1994. Frederick Tsujis laboratorium rapporterede uafhængigt af ekspressionen af ​​det rekombinante protein en måned senere. Bemærkelsesværdigt foldede GFP -molekylet og var fluorescerende ved stuetemperatur uden behov for eksogene kofaktorer, der var specifikke for vandmændene. Selvom denne nær-wtGFP var fluorescerende, havde den adskillige ulemper, herunder dual-peaked excitation spectra, pH-følsomhed, chloridfølsomhed, dårligt fluorescenskvanteudbytte, dårlig fotostabilitet og dårlig foldning ved 37 ° C.

Den første rapporterede krystalstruktur for en GFP var den af ​​S65T-mutanten af ​​Remington-gruppen i Science i 1996. En måned senere rapporterede Phillips-gruppen uafhængigt af vildtype-GFP-strukturen i Nature Biotechnology . Disse krystalstrukturer gav en vigtig baggrund for kromofordannelse og tilstødende restinteraktioner. Forskere har ændret disse rester ved direkte og tilfældig mutagenese for at producere en lang række GFP -derivater, der er i brug i dag. Yderligere forskning i GFP har vist, at det er resistent over for rengøringsmidler, proteaser, guanidiniumchlorid (GdmCl) behandlinger og drastiske temperaturændringer.

GFP -derivater

Mangfoldigheden af ​​genetiske mutationer illustreres ved denne San Diego -strandscene tegnet med levende bakterier, der udtrykker 8 forskellige farver fluorescerende proteiner (afledt af GFP og dsRed).

På grund af potentialet for udbredt brug og forskernes udviklende behov er mange forskellige mutanter af GFP blevet konstrueret. Den første store forbedring var en enkelt punktmutation (S65T) rapporteret i 1995 i Nature af Roger Tsien . Denne mutation forbedrede dramatisk de spektrale egenskaber ved GFP, hvilket resulterede i øget fluorescens, fotostabilitet og et skift af den store excitationstop til 488 nm, med topemissionen på 509 nm. Dette matchede de spektrale egenskaber ved almindeligt tilgængelige FITC -filtersæt, hvilket øgede anvendeligheden af ​​den generelle forsker. En 37 ° C foldningseffektivitet (F64L) -mutant til dette stillads, hvilket gav forbedret GFP ( EGFP ), blev opdaget i 1995 af laboratorierne i Thastrup og Falkow. EGFP tillod praktisk brug af GFP'er i pattedyrsceller. EGFP har en ekstinktionskoefficient (betegnet ε) på 55.000 M ⁻¹ cm ⁻¹ . Fluorescensen kvantumudbytte (QY) af EGFP er 0,60. Den relative lysstyrke, udtrykt som ε • QY, er 33.000 M ⁻¹ cm ⁻¹ .

Supermappe GFP ( sfGFP ), en række mutationer, der gør det muligt for GFP at folde hurtigt og modnes, selv når det smeltes til dårligt foldende peptider, blev rapporteret i 2006.

Mange andre mutationer er blevet foretaget, herunder farve mutanter; især blåt fluorescerende protein (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), cyan fluorescerende protein (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) og gule fluorescerende proteinderivater (YFP, Citrine, Venus, YPet). BFP -derivater (undtagen mKalama1) indeholder Y66H -substitutionen. De udviser et bredt absorptionsbånd i ultraviolet centreret tæt på 380 nanometer og et emissionsmaksimum på 448 nanometer. En grøn fluorescerende proteinmutant ( BFPms1 ), der fortrinsvis binder Zn (II) og Cu (II), er blevet udviklet. BFPms1 har flere vigtige mutationer, herunder og BFP-kromoforen (Y66H), Y145F for højere kvanteudbytte, H148G for at skabe et hul i beta-tønden og flere andre mutationer, der øger opløseligheden. Zn (II) binding øger fluorescensintensiteten, mens Cu (II) binding slukker fluorescens og flytter maksimal absorbans fra 379 til 444 nm. Derfor kan de bruges som Zn biosensor.

En palet af varianter af GFP og DsRed.

Kromoforbinding . Den kritiske mutation i cyanderivater er Y66W -substitutionen, som får kromoforen til at dannes med en indol frem for phenolkomponent. Flere yderligere kompenserende mutationer i den omgivende tønde er påkrævet for at genoprette lysstyrken til denne modificerede kromofor på grund af den øgede masse af indolgruppen. I ECFP og Cerulean udviser den N-terminale halvdel af den syvende streng to konformationer. Disse konformationer har begge et komplekst sæt van der Waals -interaktioner med kromoforen. Y145A- og H148D -mutationerne i Cerulean stabiliserer disse interaktioner og gør det muligt for kromoforen at være mere plan, bedre pakket og mindre tilbøjelig til kollisionskølende.

Yderligere stedorienteret tilfældig mutagenese i kombination med fluorescens levetid baseret screening har yderligere stabiliseret den syvende β-streng, hvilket resulterer i en lys variant, mTurquoise2, med et kvanteudbytte (QY) på 0,93. Den rødforskudte bølgelængde af YFP-derivaterne opnås ved T203Y-mutationen og skyldes π-elektronstableringsinteraktioner mellem den substituerede tyrosinrest og chromoforen. Disse to klasser af spektralvarianter bruges ofte til Förster -resonansenergioverførsel ( FRET ) -forsøg. Genetisk kodede FRET -journalister, der er følsomme over for cellesignalmolekyler, såsom calcium eller glutamat, proteinfosforyleringstilstand, proteinkomplementering, receptordimerisering og andre processer giver yderst specifikke optiske aflæsninger af celleaktivitet i realtid.

Semirational mutagenese af en række rester førte til pH-følsomme mutanter kendt som pHluoriner og senere superekliptiske pHluoriner. Ved at udnytte den hurtige ændring i pH ved synaptisk vesikelfusion er pHluoriner mærket til synaptobrevin blevet brugt til at visualisere synaptisk aktivitet i neuroner.

Redox følsom GFP ( roGFP ) blev konstrueret ved introduktion af cystein i betatønderstrukturen . Den redox tilstand af cysteinerne bestemmer de fluorescerende egenskaber af roGFP .

Nomenklatur

Nomenklaturen for modificerede GFP'er er ofte forvirrende på grund af overlappende kortlægning af flere GFP -versioner på et enkelt navn. For eksempel refererer mGFP ofte til en GFP med en N-terminal palmitoylering, der får GFP til at binde til cellemembraner . Imidlertid bruges det samme udtryk også til at referere til monomer GFP, som ofte opnås ved at dimer -grænsefladen bryder A206K -mutation. GFP af vild type har en svag dimeriseringstendens ved koncentrationer over 5 mg/ml. mGFP står også for "modificeret GFP", som er blevet optimeret gennem aminosyreudveksling til stabil ekspression i planteceller.

I naturen

Levende lancet ( B. floridae ) under et fluorescerende mikroskop.

Grøn fluorescens i den marine copepod Pontella mimocerami.

Formålet med både (primær) bioluminescens (fra aequorins virkning på luciferin) og (sekundær) fluorescens af GFP i vandmænd er ukendt. GFP udtrykkes samtidigt med aequorin i små granulater omkring kanten af ​​manetklokken. Den sekundære excitationstop (480 nm) af GFP absorberer noget af den blå emission af aequorin, hvilket giver bioluminescensen en mere grøn nuance. Serin 65-resten af ​​GFP- chromoforen er ansvarlig for de tospidsede excitationsspektre af vildtype GFP. Det bevares i alle tre GFP -isoformer, der oprindeligt var klonet af Prasher. Næsten alle mutationer af denne rest konsoliderer excitationsspektrene til en enkelt top ved enten 395 nm eller 480 nm. Den præcise mekanisme for denne følsomhed er kompleks, men det ser ud til, at donation af et hydrogen fra serin 65 til glutamat 222, som påvirker chromophore -ionisering. Da en enkelt mutation dramatisk kan øge excitationstoppen på 480 nm, hvilket gør GFP til en meget mere effektiv partner for aequorin, synes A. victoria evolutionært at foretrække det mindre effektive excitationsspektrum med to spidser. Roger Tsien har spekuleret i, at varierende hydrostatisk tryk med dybde kan påvirke serin 65's evne til at donere et brint til kromoforen og ændre forholdet mellem de to excitationstoppe. Således kan vandmændene ændre farven på dens bioluminescens med dybde. Et sammenbrud i bestanden af ​​vandmænd i Friday Harbor , hvor GFP oprindeligt blev opdaget, har imidlertid hæmmet yderligere undersøgelse af GFP's rolle i vandmændens naturlige miljø.

De fleste lancetarter vides at producere GFP i forskellige områder af deres krop. I modsætning til A. victoria producerer lancetter ikke deres eget blå lys, og oprindelsen af ​​deres endogene GFP er stadig ukendt. Nogle spekulerer i, at det tiltrækker plankton mod lanceletens munding og fungerer som en passiv jagtmekanisme. Det kan også fungere som et fotobeskyttelsesmiddel i larverne og forhindre skader forårsaget af højintensivt blåt lys ved at omdanne det til grønt lys med lavere intensitet. Disse teorier er imidlertid ikke blevet testet.

GFP-lignende proteiner er blevet fundet i flere arter af marine copepoder , især fra Pontellidae og Aetideidae familier. GFP isoleret fra Pontella mimocerami har vist høje lysstyrker med et kvanteudbytte på 0,92, hvilket gør dem næsten to gange lysere end den almindeligt anvendte EGFP isoleret fra A. victoria.

Andre fluorescerende proteiner

Forskellige proteiner producerer forskellige fluorescerende farver, når de udsættes for ultraviolet lys.

Der er mange GFP-lignende proteiner, der på trods af at de er i den samme proteinfamilie som GFP, ikke er direkte afledt af Aequorea victoria . Disse inkluderer dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP/IrisFP, Dendra og så videre. Efter at være blevet udviklet fra proteiner i forskellige organismer, kan disse proteiner undertiden vise unantiperede tilgange til kromofordannelse. Nogle af disse, såsom KFP, er udviklet af naturligt ikke- eller svagt-fluorescerende proteiner, der skal forbedres kraftigt ved mutagenese. Når GFP-lignende tønder med forskellige spektraegenskaber bruges, kan excitationsspektrene for en kromofor bruges til at drive en anden kromofor (FRET), hvilket muliggør omdannelse mellem lysets bølgelængder.

FMN-bindende fluorescerende proteiner (FbFP'er) blev udviklet i 2007 og er en klasse af små (11-16 kDa), iltuafhængige fluorescerende proteiner, der er afledt af blålysreceptorer. De er specielt beregnet til anvendelse under anaerobe eller hypoksiske forhold, da dannelsen og bindingen af ​​Flavin -kromoforen ikke kræver molekylært oxygen, som det er tilfældet med syntesen af ​​GFP -kromoforen.

Hvidt lysbillede eller billede set af øjet af fluorescerende proteiner i billedet ovenfor.

Fluorescerende proteiner med andre kromoforer, såsom UnaG med bilirubin, kan vise unikke egenskaber som rødforskudt emission over 600 nm eller fotokonvertering fra en grønemitterende tilstand til en rødemitterende tilstand. De kan have excitations- og emissionsbølgelængder langt nok fra hinanden til at opnå konvertering mellem rødt og grønt lys.

En ny klasse af fluorescerende protein blev udviklet fra et cyanobakterielt ( Trichodesmium erythraeum ) phycobiliprotein , α- allophycocyanin og navngivet lille ultrarødt fluorescerende protein ( smURFP ) i 2016. smURFP inkorporerer autokatalytisk selv chromophore biliverdin uden behov for et eksternt protein , kendt som en lyase . Vandmænd - og koral afledt GFP-lignende proteiner kræver oxygen og producere en støkiometrisk mængde af hydrogenperoxid ved kromofor -dannelse. smURFP kræver ikke ilt eller producerer hydrogenperoxid og bruger kromoforen , biliverdin . smURFP har en stor udryddelseskoefficient (180.000 M ⁻¹ cm ⁻¹ ) og har et beskedent kvanteudbytte (0,20), hvilket gør den sammenlignelig biofysisk lysstyrke med eGFP og ~ 2 gange lysere end de fleste røde eller langt røde fluorescerende proteiner afledt af koral . smURFP spektrale egenskaber ligner det organiske farvestof Cy5 .

E. coli -kolonier, der udtrykker fluorescerende proteiner.

Anmeldelser af nye klasser af fluorescerende proteiner og anvendelser kan findes i de citerede anmeldelser.

Struktur

Model til spontan dannelse af HBI -fluoroforen (markeret med grønt) i wtGFP.

GFP har en beta-tønde struktur bestående af elleve β-tråde med et plisseret arkarrangement, med en alfa-helix indeholdende den kovalent bundne chromophore 4- ( p- hydroxybenzyliden) imidazolidin-5-on (HBI), der løber gennem midten. Fem kortere alfa -spiraler danner hætter i enderne af strukturen. Den beta barrel struktur er en næsten perfekt cylinder, 42a lang og 24A i diameter (nogle undersøgelser har rapporteret en diameter på 30 Å), lave, hvad der omtales som en "β-can" formation, som er unik for GFP-lignende familie . HBI, den spontant modificerede form af tripeptidet Ser65 – Tyr66 – Gly67, er ikke-fluorescerende i fravær af det korrekt foldede GFP-stillads og findes hovedsageligt i den ikke-ioniserede phenolform i wtGFP. Indadvendte sidekæder i tønden inducerer specifikke cykliseringsreaktioner i Ser65 – Tyr66 – Gly67, der inducerer ionisering af HBI til phenolatformen og chromofordannelse . Denne proces med post-translationel ændring kaldes modning . Hydrogenbindingsnetværket og elektronstablende interaktioner med disse sidekæder påvirker farven, intensiteten og fotostabiliteten af ​​GFP og dets mange derivater. Tøndernes tætpakket natur udelukker opløsningsmiddelmolekyler og beskytter kromoforfluorescensen mod slukning med vand. Ud over autocykliseringen af ​​Ser65-Tyr66-Gly67 sker der en 1,2-dehydrogeneringsreaktion ved Tyr66-resten. Udover de tre rester, der danner kromoforen, fungerer rester som Gln94, Arg96, His148, Thr203 og Glu222 alle som stabilisatorer. Resterne af Gln94, Arg96 og His148 er i stand til at stabilisere sig ved delokalisering af chromoforladningen. Arg96 er den vigtigste stabiliserende rest på grund af det faktum, at det får de nødvendige strukturelle justeringer, der er nødvendige fra HBI -ringen, til at forekomme. Enhver mutation til Arg96 -resten ville resultere i et fald i kromoforens udviklingshastighed, fordi korrekte elektrostatiske og steriske interaktioner ville gå tabt. Tyr66 er modtageren af ​​hydrogenbindinger og ioniserer ikke for at producere gunstig elektrostatik.

GFP -film, der viser hele strukturen og zoomer ind på fluorescerende kromofor.

GFP-molekyler tegnet i tegneseriestil, et helt og et med siden af betatønden skåret væk for at afsløre kromoforen (fremhævet som kugle-og-stav ). Fra FBF : 1GFL .

GFP -bånddiagram. Fra FBF : 1EMA .

Ansøgninger

Reporter analyser

Grønt fluorescerende protein kan anvendes som et reportergen .

F.eks. Kan GFP bruges som reporter for miljøgiftstoksiske niveauer. Dette protein har vist sig at være en effektiv måde at måle toksicitetsniveauer for forskellige kemikalier, herunder ethanol, p -formaldehyd, phenol, triclosan og paraben. GFP er fantastisk som et reporterprotein, fordi det ikke har nogen effekt på værten, når det introduceres til værtens cellulære miljø. På grund af denne evne er der ikke behov for ekstern visualiseringsplet, ATP eller kofaktorer. Med hensyn til forurenende niveauer blev fluorescensen målt for at måle den effekt, som forurenende stoffer har på værtscellen. Værtscellens celletæthed blev også målt. Resultater fra undersøgelsen foretaget af Song, Kim og Seo (2016) viste, at der var et fald i både fluorescens og celletæthed, da forurenende niveauer steg. Dette var tegn på, at cellulær aktivitet var faldet. Mere forskning i denne specifikke applikation for at bestemme den mekanisme, hvormed GFP fungerer som en forurenende markør. Lignende resultater er blevet observeret i zebrafisk, fordi zebrafisk, der blev injiceret med GFP, var cirka tyve gange mere modtagelige for at genkende cellulære belastninger end zebrafisk, der ikke blev injiceret med GFP.

Fordele

Den største fordel ved GFP er, at den kan være arvelig, afhængig af hvordan den blev introduceret, hvilket giver mulighed for fortsat undersøgelse af celler og væv, den kommer til udtryk i. Visualisering af GFP er ikke -invasiv og kræver kun belysning med blåt lys. GFP alene forstyrrer ikke biologiske processer, men når det smeltes til proteiner af interesse, kræves omhyggelig design af linkere for at opretholde funktionen af ​​proteinet af interesse. Hvis den bruges sammen med en monomer, er den desuden i stand til let at diffundere gennem cellerne.

Fluorescensmikroskopi

Superopløsning med to fusionsproteiner (GFP-Snf2H og RFP-H2A), Co-lokaliseringsundersøgelser (2CLM) i kernen i en knoglekræftcelle. 120.000 lokaliserede molekyler i et vidfeltområde (470 µm ² ).

Tilgængeligheden af ​​GFP og dets derivater har grundigt omdefineret fluorescensmikroskopi og den måde, den bruges i cellebiologi og andre biologiske discipliner. Mens de fleste små fluorescerende molekyler som FITC (fluorescein isothiocyanat) er stærkt fototoksiske, når de bruges i levende celler, er fluorescerende proteiner som GFP normalt meget mindre skadelige, når de belyses i levende celler. Dette har udløst udviklingen af ​​stærkt automatiserede levende celle-fluorescensmikroskopisystemer, som kan bruges til at observere celler over tid og udtrykke et eller flere proteiner mærket med fluorescerende proteiner.

Der er mange teknikker til at udnytte GFP i et levende celle -billeddannelseseksperiment. Den mest direkte måde at bruge GFP på er ved direkte at knytte den til et protein af interesse. For eksempel kan GFP inkluderes i et plasmid, der udtrykker andre gener for at indikere en vellykket transfektion af et gen af ​​interesse. En anden metode er at bruge en GFP, der indeholder en mutation, hvor fluorescensen vil ændre sig fra grønt til gult over tid, som omtales som en fluorescerende timer. Med fluorescerende timer kan forskere studere tilstanden af ​​proteinproduktion, såsom nyligt aktiveret, kontinuerligt aktiveret eller for nylig deaktiveret baseret på den farve, der er rapporteret af det fluorescerende protein. I endnu et andet eksempel har forskeren ændret GFP til først at blive aktiv efter udsættelse for bestråling, hvilket giver forskere et værktøj til selektivt at aktivere bestemte dele af en celle og observere, hvor proteiner mærket med GFP bevæger sig fra startstedet. Disse er kun to eksempler i et spirende felt af fluorescerende mikrokopi og en mere komplet gennemgang af biosensorer, der anvender GFP og andre fluorescerende proteiner, kan findes her

For eksempel havde GFP været meget udbredt til mærkning af forskellige organismeres spermatozoer til identifikationsformål som i Drosophila melanogaster , hvor ekspression af GFP kan bruges som markør for en bestemt egenskab. GFP kan også udtrykkes i forskellige strukturer, der muliggør morfologisk sondring. I sådanne tilfælde inkorporeres genet til produktion af GFP i genomet af organismen i DNA -området, der koder for målproteinerne, og som kontrolleres af den samme regulatoriske sekvens ; det vil sige, at genets regulatoriske sekvens nu styrer produktionen af ​​GFP, ud over det / de mærkede protein (er). I celler, hvor genet udtrykkes, og de mærkede proteiner produceres, produceres GFP på samme tid. Således vil kun de celler, hvori det mærkede gen udtrykkes, eller målproteinerne produceres, fluorescere, når de observeres under fluorescensmikroskopi. Analyse af sådanne time -lapse -film har redefineret forståelsen af ​​mange biologiske processer, herunder proteinfoldning, proteintransport og RNA -dynamik, som tidligere var blevet undersøgt ved hjælp af fast (dvs. dødt) materiale. Indhentede data bruges også til at kalibrere matematiske modeller for intracellulære systemer og til at estimere genekspressionshastigheder. På samme måde kan GFP bruges som en indikator for proteinekspression i heterologe systemer. I dette scenario indføres fusionsproteiner indeholdende GFP indirekte ved hjælp af RNA i konstruktionen eller direkte med det mærkede protein selv. Denne metode er nyttig til at studere strukturelle og funktionelle egenskaber ved det mærkede protein på en makromolekylær eller enkeltmolekylær skala med fluorescensmikroskopi.

Den Vertico SMI mikroskop under anvendelse af SPDM Phymod teknologi anvender den såkaldte "reversibel fotoblegning" effekt af fluorescerende farvestoffer såsom GFP og dets derivater til lokalisere dem som enkelte molekyler i en optisk opløsning på 10 nm. Dette kan også udføres som en co-lokalisering af to GFP-derivater (2CLM).

En anden kraftfuld anvendelse af GFP er at udtrykke proteinet i små sæt af specifikke celler. Dette giver forskere mulighed for optisk at opdage bestemte celletyper in vitro (i en skål) eller endda in vivo (i den levende organisme). Genetisk at kombinere flere spektrale varianter af GFP er et nyttigt trick til analyse af hjernekredsløb ( Brainbow ). Andre interessante anvendelser af fluorescerende proteiner i litteraturen indbefatter anvendelse rammeprogrammerne som sensorer neuron membranpotentiale , sporing af AMPA -receptorer på cellemembraner, virusindtrængen og infektionen af individuelle influenza virus og lentivirale vira, etc.

Det er også blevet fundet, at nye linjer af transgene GFP -rotter kan være relevante for genterapi såvel som regenerativ medicin. Ved at bruge "high-expresser" GFP viser transgene rotter et højt udtryk i de fleste væv og mange celler, der ikke er blevet karakteriseret eller kun er blevet dårligt karakteriseret i tidligere GFP-transgene rotter.

GFP har vist sig at være nyttig i kryobiologi som et levedygtighedsassay . Korrelation af levedygtighed målt ved trypanblå assays var 0,97. En anden anvendelse er brugen af ​​GFP-co-transfektion som intern kontrol for transfektionseffektivitet i pattedyrceller.

En ny mulig anvendelse af GFP omfatter brug af den som en følsom monitor af intracellulære processer via et eGFP -lasersystem fremstillet af en human embryonisk nyrecellelinje. Den første konstruerede levende laser er fremstillet af en eGFP -udtrykkende celle inde i et reflekterende optisk hulrum og rammer den med pulser af blåt lys. Ved en bestemt pulstærskel bliver eGFP's optiske output lysere og fuldstændig ensartet i farven ren grøn med en bølgelængde på 516 nm. Før det udsendes som laserlys, hopper lyset frem og tilbage i resonatorhulrummet og passerer cellen adskillige gange. Ved at studere ændringerne i optisk aktivitet kan forskere bedre forstå cellulære processer.

GFP bruges meget i kræftforskning til at mærke og spore kræftceller. GFP-mærkede kræftceller er blevet brugt til at modellere metastase, den proces, hvorved kræftceller spredes til fjerne organer.

Split GFP

GFP kan bruges til at analysere kolokalisering af proteiner. Dette opnås ved at "opdele" proteinet i to fragmenter, som er i stand til at samle sig selv og derefter fusionere hver af disse til de to proteiner af interesse. Alene disse ufuldstændige GFP -fragmenter er ude af stand til at fluorescere. Men hvis de to proteiner af interesse kolokaliseres, samles de to GFP-fragmenter sammen for at danne en GFP-lignende struktur, der er i stand til at fluorescere. Derfor er det ved at måle fluorescensniveauet muligt at bestemme, om de to proteiner af interesse kolokaliseres.

Makrofotografering

Makroskala biologiske processer, såsom spredning af virusinfektioner, kan følges ved hjælp af GFP-mærkning. Tidligere er mutagent ultraviolet lys (UV) blevet brugt til at belyse levende organismer (f.eks. Se) til at detektere og fotografere GFP -udtrykket. For nylig er en teknik, der bruger ikke-mutagene LED-lys, blevet udviklet til makrofotografering. Teknikken anvender en epifluorescens kamera vedhæftet fil baseret på det samme princip, der bruges i konstruktionen af epifluorescens mikroskoper .

Transgene kæledyr

Mus, der udtrykker GFP under UV -lys (venstre og højre), sammenlignet med normal mus (i midten)

Alba , en grøn-fluorescerende kanin, blev skabt af et fransk laboratorium bestilt af Eduardo Kac ved hjælp af GFP til kunstformål og sociale kommentarer. Det amerikanske firma Yorktown Technologies markedsfører til akvariebutikker grønne fluorescerende zebrafisk ( GloFish ), der oprindeligt blev udviklet til at opdage forurening i vandveje. NeonPets, et amerikansk firma, har markedsført grønne fluorescerende mus til kæledyrsindustrien som NeonMice. Grønne fluorescerende grise, kendt som Noels, blev opdrættet af en gruppe forskere under ledelse af Wu Shinn-Chih ved Institut for Animal Science and Technology ved National Taiwan University . Et japansk-amerikansk team skabte grønne-fluorescerende katte som bevis på konceptet for potentielt at bruge dem som modelorganismer for sygdomme, især HIV . I 2009 avlede et sydkoreansk team fra Seoul National University de første transgene beagles med fibroblastceller fra søanemoner. Hundene afgiver et rødt lysstofrør, og de skal give forskere mulighed for at studere de gener, der forårsager menneskelige sygdomme som narkolepsi og blindhed.

Kunst

Julian Voss-Andreae , en tyskfødt kunstner med speciale i "proteinskulpturer", skabte skulpturer baseret på GFP's struktur, herunder det 1,70 m høje "grønne fluorescerende protein" (2004) og det 1,40 m ( 4'7 ") høj" Steel Jellyfish "(2006). Sidstnævnte skulptur er placeret på stedet for GFP's opdagelse af Shimomura i 1962, University of Washington 's Friday Harbor Laboratories .

Julian Voss-Andreaes GFP-baserede skulptur Steel Jellyfish (2006). Billedet viser skulpturen i rustfrit stål på Friday Harbor Laboratories på San Juan Island (Wash., USA), stedet for GFP's opdagelse.

Se også

• Protein mærke
• pGLO
• Gul fluorescerende protein
• Genetisk kodet spændingsindikator

Referencer

Yderligere læsning

eksterne links

• En omfattende artikel om fluorescerende proteiner på Scholarpedia
• Kort resumé af skelsættende GFP -papirer
• Interaktiv Java -applet, der demonstrerer kemien bag dannelsen af ​​GFP -kromoforen
• Video af 2008 Nobelprisforedrag af Roger Tsien om fluorescerende proteiner
• Excitations- og emissionsspektre for forskellige fluorescerende proteiner
• Green Fluorescent Protein Chem Soc Rev. -temaudgave dedikeret til 2008 -nobelprisvinderne i kemi, professorerne Osamu Shimomura , Martin Chalfie og Roger Y. Tsien
• Månedens molekyle, juni 2003 : en illustreret oversigt over GFP af David Goodsell.
• Månedens molekyle, juni 2014 : en illustreret oversigt over GFP-lignende varianter af David Goodsell.
• Grønt fluorescerende protein på FPbase, en fluorescerende proteindatabase
• Oversigt over alle de tilgængelige strukturoplysninger i PDB for UniProt : P42212 (grønt fluorescerende protein) på PDBe-KB .