Monoklonalt antistof - Monoclonal antibody

En generel fremstilling af den metode, der bruges til at producere monoklonale antistoffer.

Et monoklonalt antistof ( mAb eller moAb ) er et antistof fremstillet ved kloning af en unik hvid blodlegeme . Alle efterfølgende antistoffer stammer på denne måde tilbage til en unik forældercelle.

Monoklonale antistoffer kan have monovalent affinitet og bindes kun til den samme epitop (den del af et antigen , der genkendes af antistoffet). I modsætning hertil binder polyklonale antistoffer til flere epitoper og fremstilles normalt af flere forskellige antistoffer, der udskiller plasmacellelinier . Bispecifikke monoklonale antistoffer kan også konstrueres ved at øge de terapeutiske mål for et monoklonalt antistof til to epitoper.

Det er muligt at producere monoklonale antistoffer, der specifikt binder til praktisk talt ethvert egnet stof; de kan derefter tjene til at opdage eller rense det. Denne kapacitet er blevet et vigtigt redskab inden for biokemi , molekylærbiologi og medicin .

Historie

I begyndelsen af ​​1900'erne foreslog immunolog Paul Ehrlich ideen om en Zauberkugel- " magisk kugle ", opfattet som en forbindelse, der selektivt målrettede en sygdomsfremkaldende organisme og kunne levere et toksin til den organisme. Dette understøttede begrebet monoklonale antistoffer og monoklonale lægemiddelkonjugater. Ehrlich og Élie Metchnikoff modtog 1908 Nobelprisen i fysiologi eller medicin for at levere det teoretiske grundlag for immunologi.

I 1970'erne var lymfocytter, der producerede et enkelt antistof, kendt i form af multipelt myelom -en kræft, der påvirker B-celler . Disse unormale antistoffer eller paraproteiner blev brugt til at studere strukturen af ​​antistoffer, men det var endnu ikke muligt at producere identiske antistoffer specifikke for et givet antigen . I 1973 beskrev Jerrold Schwaber produktionen af ​​monoklonale antistoffer ved hjælp af hybrid -human -mus -celler. Dette arbejde er fortsat bredt omtalt blandt dem, der bruger human-afledte hybridomer . I 1975 lykkedes det Georges Köhler og César Milstein at lave fusioner af myelomcellelinier med B -celler til at skabe hybridomer, der kunne producere antistoffer, der er specifikke for kendte antigener, og som blev udødeliggjort. De og Niels Kaj Jerne delte Nobelprisen i fysiologi eller medicin i 1984 for opdagelsen.

I 1988 foregik Greg Winter og hans team inden for teknikkerne til humanisering af monoklonale antistoffer, hvilket eliminerede de reaktioner, som mange monoklonale antistoffer forårsagede hos nogle patienter. I 1990'erne gjorde forskningen fremskridt med anvendelse af monoklonale antistoffer terapeutisk, og i 2018 modtog James P. Allison og Tasuku Honjo Nobelprisen i fysiologi eller medicin for deres opdagelse af kræftterapi ved at hæmme negativ immunregulering ved hjælp af monoklonale antistoffer, der forhindrer hæmmende forbindelser.

Produktion

Forskere ser på dias af kulturer af celler, der danner monoklonale antistoffer. Disse dyrkes i et laboratorium, og forskerne analyserer produkterne for at vælge den mest lovende af dem.
Monoklonale antistoffer kan dyrkes i ubegrænsede mængder i flasker som dem, der er vist på dette billede.
Tekniker håndfylder brønde med en væske til en forskningstest. Denne test involverer fremstilling af kulturer, hvor hybrider dyrkes i store mængder for at producere ønsket antistof. Dette sker ved at fusionere en myelom celle og en mus lymfocyt til dannelse af en hybrid celle ( hybridom ).
Laboratorietekniker bader klargjorte dias i en opløsning. Denne tekniker forbereder dias af monoklonale antistoffer til forskere. De viste celler mærker human brystkræft .

Hybridoma udvikling

Meget af arbejdet bag produktion af monoklonale antistoffer er forankret i produktionen af ​​hybridomer, hvilket indebærer identifikation af antigenspecifikke plasma-/plasmablastceller (ASPC), der producerer antistoffer, der er specifikke for et antigen af ​​interesse og fusionerer disse celler med myelomceller . Kanin B-celler kan bruges til at danne et kaninhybridom . Polyethylenglycol bruges til at fusionere tilstødende plasmamembraner, men succesraten er lav, så der bruges et selektivt medium, hvor kun smeltede celler kan vokse. Dette er muligt, fordi myelomceller har mistet evnen til at syntetisere hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (HGPRT), et enzym, der er nødvendigt for bjærgningssyntesen af nukleinsyrer. Fraværet af HGPRT er ikke et problem for disse celler, medmindre de novo purinsyntesebanen også forstyrres. At udsætte celler for aminopterin (en folsyreanalog , der hæmmer dihydrofolatreduktase , DHFR), gør dem ude af stand til at bruge de novo -vejen og bliver fuldstændig auxotrofiske for nukleinsyrer , hvilket kræver tilskud for at overleve.

Det selektive dyrkningsmedium kaldes HAT -medium, fordi det indeholder hypoxanthin , aminopterin og thymidin . Dette medium er selektivt for fusionerede ( hybridoma ) celler. Ubundne myelomceller kan ikke vokse, fordi de mangler HGPRT og dermed ikke kan replikere deres DNA. Ubundne miltceller kan ikke vokse på ubestemt tid på grund af deres begrænsede levetid. Kun fusionerede hybridceller, der kaldes hybridomer, er i stand til at vokse på ubestemt tid i mediet, fordi miltcellepartneren leverer HGPRT, og myelompartneren har træk, der gør den udødelig (ligner en kræftcelle).

Denne blanding af celler fortyndes derefter, og kloner dyrkes fra enlige forælderceller på mikrotiterbrønde. Antistofferne udskilt af de forskellige kloner analyseres derefter for deres evne til at binde til antigenet (med en test såsom ELISA eller antigenmikroarrayassay) eller immun- dot-blot . Den mest produktive og stabile klon vælges derefter til fremtidig brug.

Hybridomer kan dyrkes på ubestemt tid i et egnet cellekulturmedium. De kan også injiceres i mus (i bughulen , der omgiver tarmen). Der producerer de tumorer, der udskiller en antistofrig væske kaldet ascitesvæske .

Mediet skal beriges under in vitro -selektion for yderligere at favorisere hybridomvækst. Dette kan opnås ved anvendelse af et lag af føderfibrocytceller eller supplementmedium, såsom briclone. Kulturmedier betinget af makrofager kan bruges. Produktion i cellekultur foretrækkes normalt, da ascites -teknikken er smertefuld for dyret. Hvor der findes alternative teknikker, betragtes ascites som uetisk .

Ny mAb -udviklingsteknologi

Flere monoklonale antistofteknologier er blevet udviklet for nylig, såsom fagvisning , enkelt B -cellekultur, amplifikation af enkeltceller fra forskellige B -cellepopulationer og enkeltplasmacelleforespørgselsteknologier. I modsætning til traditionel hybridomateknologi anvender de nyere teknologier molekylærbiologiske teknikker til at forstærke de tunge og lette kæder af antistofgenerne ved PCR og producere i enten bakterielle eller pattedyrsystemer med rekombinant teknologi. En af fordelene ved de nye teknologier er anvendelig på flere dyr, såsom kanin, lama, kylling og andre almindelige forsøgsdyr i laboratoriet.

Oprensning

Efter opnåelse af enten en medieprøve af dyrkede hybridomer eller en prøve af ascitesvæske, skal de ønskede antistoffer ekstraheres. Cellekulturprøvekontaminanter består primært af mediekomponenter såsom vækstfaktorer, hormoner og transferriner . Derimod har in vivo -prøven sandsynligvis værtsantistoffer, proteaser , nukleaser , nukleinsyrer og vira . I begge tilfælde kan andre sekreter fra hybridomer såsom cytokiner være til stede. Der kan også være bakteriekontaminering og som følge heraf endotoksiner , der udskilles af bakterierne. Afhængig af kompleksiteten af ​​de medier, der kræves i cellekultur og dermed forurenende stoffer, kan den ene eller den anden metode ( in vivo eller in vitro ) være at foretrække.

Prøven konditioneres først eller forberedes til oprensning. Celler, celleaffald, lipider og koaguleret materiale fjernes først, typisk ved centrifugering efterfulgt af filtrering med et 0,45 µm filter. Disse store partikler kan forårsage et fænomen kaldet membranforurening i senere rensningstrin. Derudover er koncentrationen af ​​produktet i prøven muligvis ikke tilstrækkelig, især i tilfælde, hvor det ønskede antistof produceres af en lavsekreterende cellelinje. Prøven koncentreres derfor ved ultrafiltrering eller dialyse .

De fleste af de ladede urenheder er normalt anioner, såsom nukleinsyrer og endotoksiner. Disse kan adskilles ved ionbytningskromatografi . Enten kation udveksling kromatografi anvendes i en tilstrækkelig lav pH-værdi , at den ønskede antistof binder til søjlen, mens anioner strømme gennem eller anionbytningskromatografi anvendes i en tilstrækkelig høj pH-værdi, at det ønskede antistof strømmer gennem søjlen, mens anioner binder til det. Forskellige proteiner kan også adskilles sammen med anionerne baseret på deres isoelektriske punkt (pI). I proteiner er det isoelektriske punkt (pI) defineret som den pH -værdi, ved hvilken et protein ikke har nettoladning. Når pH> pI, har et protein en netto negativ ladning, og når pH <pI, har et protein en netto positiv ladning. For eksempel har albumin et pI på 4,8, hvilket er signifikant lavere end for de fleste monoklonale antistoffer, som har et pI på 6,1. Således vil den gennemsnitlige ladning af albuminmolekyler ved en pH -værdi mellem 4,8 og 6,1 sandsynligvis være mere negativ, mens mAbs -molekyler er positivt ladede, og derfor er det muligt at adskille dem. Transferrin har derimod et pI på 5,9, så det kan ikke let adskilles ved denne metode. En forskel i pI på mindst 1 er nødvendig for en god adskillelse.

Transferrin kan i stedet fjernes ved størrelsesekskluderingskromatografi . Denne metode er en af ​​de mere pålidelige kromatografiteknikker. Da vi har at gøre med proteiner, er egenskaber som ladning og affinitet ikke konsistente og varierer med pH, da molekyler protoneres og deprotoneres, mens størrelsen forbliver relativt konstant. Ikke desto mindre har den ulemper som lav opløsning, lav kapacitet og lav elueringstid .

En meget hurtigere, enkelt-trins metode til adskillelse er protein A/G- affinitetskromatografi . Antistoffet binder selektivt til protein A/G, så der opnås et højt renhedsniveau (generelt> 80%). Denne metode kan imidlertid være problematisk for antistoffer, der let beskadiges, da der generelt bruges hårde forhold. En lav pH kan bryde bindingerne for at fjerne antistoffet fra søjlen. Ud over at muligvis påvirke produktet, kan lav pH forårsage, at protein A/G selv lækker af kolonnen og forekommer i den eluerede prøve. Skånsomme elueringsbuffersystemer, der anvender høje saltkoncentrationer, er tilgængelige for at undgå at udsætte følsomme antistoffer for lav pH. Omkostninger er også en vigtig overvejelse med denne metode, fordi immobiliseret protein A/G er en dyrere harpiks.

For at opnå maksimal renhed i et enkelt trin kan affinitetsoprensning udføres ved hjælp af antigenet til at tilvejebringe specificitet for antistoffet. I denne metode er antigenet, der bruges til at generere antistoffet, kovalent knyttet til en agarosestøtte . Hvis antigenet er et peptid , syntetiseres det sædvanligvis med et terminal cystein , som tillader selektiv binding til et bærerprotein, såsom KLH under udvikling og for at understøtte oprensning. Det antistofholdige medium inkuberes derefter med det immobiliserede antigen, enten i batch eller som antistoffet ledes gennem en søjle, hvor det selektivt binder og kan tilbageholdes, mens urenheder vaskes væk. En eluering med en buffer med lav pH -værdi eller en mere skånsom elueringsbuffer med højt saltindhold anvendes derefter til at genvinde renset antistof fra bæreren.

Antistoffeterogenitet

Produkt heterogenitet er almindelig i monoklonale antistoffer og andre rekombinante biologiske produkter og introduceres typisk enten opstrøms under ekspression eller nedstrøms under fremstilling.

Disse varianter er typisk aggregater, deamideringsprodukter , glykosyleringsvarianter , oxiderede aminosyresidekæder samt amino- og carboxylterminale aminosyretilsætninger. Disse tilsyneladende små strukturelle ændringer kan påvirke præklinisk stabilitet og procesoptimering samt terapeutisk produktstyrke, biotilgængelighed og immunogenicitet . Den generelt accepterede oprensningsmetode for processtrømme for monoklonale antistoffer inkluderer indfangning af produktmålet med protein A , eluering, forsuring for at inaktivere potentielle pattedyrvira, efterfulgt af ionkromatografi , først med anionperler og derefter med kationperler.

Forskydning kromatografi er blevet anvendt til at identificere og karakterisere disse ofte usete varianter i mængder, der er egnet til efterfølgende prækliniske evaluering regimer såsom animalske farmakokinetiske studier. Viden opnået i den prækliniske udviklingsfase er afgørende for forbedret produktkvalitetsforståelse og danner grundlag for risikostyring og øget lovgivningsmæssig fleksibilitet. Den nylige Food and Drug Administration's Quality by Design -initiativ forsøger at give vejledning om udvikling og lette design af produkter og processer, der maksimerer effektivitet og sikkerhedsprofil og samtidig forbedrer produktets fremstillingsevne.

Rekombinant

Produktionen af rekombinante monoklonale antistoffer involverer repertoire kloning , CRISPR / Cas9 eller fag display / gær display teknologier. Rekombinant antistofteknik involverer antistofproduktion ved anvendelse af vira eller gær snarere end mus. Disse teknikker er afhængige af hurtig kloning af immunglobulingenesegmenter for at skabe biblioteker med antistoffer med lidt forskellige aminosyresekvenser, hvorfra antistoffer med ønskede specificiteter kan vælges. Fagantistofbibliotekerne er en variant af fagantigenbiblioteker. Disse teknikker kan bruges til at forbedre den specificitet, hvormed antistoffer genkender antigener, deres stabilitet under forskellige miljøforhold, deres terapeutiske virkning og deres påviselighed i diagnostiske applikationer. Fermenteringskamre er blevet brugt til antistofproduktion i stor skala.

Kimære antistoffer

Mens mus og humane antistoffer strukturelt ligner forskellene mellem dem, var tilstrækkelige til at påkalde et immunrespons, når murine monoklonale antistoffer blev injiceret i mennesker, hvilket resulterede i deres hurtige fjernelse fra blodet, såvel som systemiske inflammatoriske virkninger og produktionen af humane anti- museantistoffer (HAMA).

Rekombinant DNA er blevet undersøgt siden slutningen af ​​1980'erne for at øge opholdstiden. I en fremgangsmåde blev muse-DNA, der koder for bindingsdelen af ​​et monoklonalt antistof, fusioneret med humant antistofproducerende DNA i levende celler. Ekspressionen af ​​dette " kimære " eller "humaniserede" DNA gennem cellekultur gav del-mus, del-humane antistoffer.

Menneskelige antistoffer

Der er udviklet tilgange til at isolere humane monoklonale antistoffer

Lige siden opdagelsen af, at monoklonale antistoffer kunne dannes, har forskere målrettet oprettelsen af fuldt menneskelige produkter for at reducere bivirkningerne af humaniserede eller kimære antistoffer. Flere vellykkede tilgange er blevet identificeret: transgene mus , fagvisning og enkelt B -cellekloning:

I november 2016 blev tretten af ​​de nitten fuldt humane monoklonale antistofterapeutika på markedet afledt af transgene musteknologi.

Adoption af organisationer, der markedsfører transgen teknologi omfatter:

  • Abgenix - som markedsførte Xenomouse -teknologien. Abgenix blev opkøbt i april 2006 af Amgen .
  • Regeneron Pharmaceuticals VelocImmune -teknologi.
  • Kymab - der markedsfører deres Kymouse -teknologi.
  • Åbn Monoklonal teknologis OmniRat ™ og OmniMouse ™ platform.
  • TRIANNI, Inc. - der markedsfører deres TRIANNI Mouse -platform.
  • Ablexis, LLC - der markedsfører deres AlivaMab Mouse -platform.

Fagvisning kan bruges til at udtrykke variable antistofdomæner på filamentøse faglagsproteiner ( Phage major coat protein ). Disse fagdisplay -antistoffer kan bruges til forskellige forskningsapplikationer. ProAb blev annonceret i december 1997 og involverede screening med høj kapacitet af antistofbiblioteker mod sygt og ikke-sygt væv, mens Proximol brugte en enzymatisk reaktion med frie radikaler til at mærke molekyler i nærheden af ​​et givet protein.

Monoklonale antistoffer er godkendt til behandling af kræft , hjerte -kar -sygdomme , inflammatoriske sygdomme , makuladegeneration , transplantatafstødning , multipel sklerose og virusinfektion .

I august 2006 rapporterede Pharmaceutical Research and Manufacturers of America , at amerikanske virksomheder havde 160 forskellige monoklonale antistoffer i kliniske forsøg eller afventer godkendelse fra Food and Drug Administration .

Koste

Monoklonale antistoffer er dyrere at fremstille end små molekyler på grund af de komplekse processer, der er involveret og molekylernes generelle størrelse, alt sammen udover de enorme forsknings- og udviklingsomkostninger, der er forbundet med at bringe en ny kemisk enhed til patienter. De er prissat for at give producenterne mulighed for at genvinde de typisk store investeringsomkostninger, og hvor der ikke er nogen priskontrol, f.eks. USA, kan priserne være højere, hvis de giver stor værdi. Syv forskere ved University of Pittsburgh konkluderede: "Den årlige pris på mAb -terapier er omkring $ 100.000 højere inden for onkologi og hæmatologi end i andre sygdomstilstande," idet de sammenlignes pr. Patient med dem for kardiovaskulære eller metaboliske lidelser, immunologi, infektionssygdomme, allergi og oftalmologi.

Ansøgninger

Diagnostiske tests

Når monoklonale antistoffer for et givet stof er blevet produceret, kan de bruges til at påvise tilstedeværelsen af ​​dette stof. Proteiner kan påvises ved hjælp af Western blot- og immuno dot blot -test. I immunhistokemi kan monoklonale antistoffer bruges til at detektere antigener i fikserede vævssnit, og på lignende måde kan immunfluorescens bruges til at påvise et stof i enten frosset vævssnit eller levende celler.

Analytiske og kemiske anvendelser

Antistoffer kan også bruges til at rense deres målforbindelser fra blandinger ved hjælp af metoden til immunudfældning .

Terapeutiske anvendelser

Terapeutiske monoklonale antistoffer virker gennem flere mekanismer, såsom blokering af målrettede molekylfunktioner, inducering af apoptose i celler, der udtrykker målet, eller ved at modulere signalveje.

Kræftbehandling

En mulig behandling for kræft involverer monoklonale antistoffer, der kun binder til kræftcelle-specifikke antigener og fremkalder et immunrespons mod målkræftcellen. Sådanne mAb'er kan modificeres til levering af et toksin , radioisotop , cytokin eller andet aktivt konjugat eller til at designe bispecifikke antistoffer, der kan binde med deres Fab -regioner både til målantigen og til et konjugat eller effektorcelle. Hvert intakt antistof kan binde til celleceptorer eller andre proteiner med sin Fc -region .

Monoklonale antistoffer mod kræft. ADEPT , antistofstyret enzym prodrug -terapi; ADCC : antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet; CDC: komplementafhængig cytotoksicitet ; MAb: monoklonalt antistof; scFv, enkeltkædet Fv-fragment.

MAbs godkendt af FDA for kræft omfatter:

Autoimmune sygdomme

Monoklonale antistoffer, der anvendes til autoimmune sygdomme, inkluderer infliximab og adalimumab , som er effektive til leddegigt , Crohns sygdom , ulcerøs colitis og ankyloserende spondylitis ved deres evne til at binde til og hæmme TNF-α . Basiliximab og daclizumab hæmmer IL-2 på aktiverede T-celler og hjælper derved med at forhindre akut afstødning af nyretransplantationer. Omalizumab hæmmer humant immunglobulin E (IgE) og er nyttig til behandling af moderat til svær allergisk astma .

Eksempler på terapeutiske monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer til forskningsapplikationer kan findes direkte fra antistofleverandører eller ved brug af en specialiseret søgemaskine som CiteAb . Nedenfor er eksempler på klinisk vigtige monoklonale antistoffer.

Hovedkategori Type Ansøgning Mekanisme/mål Mode
anti
inflammatorisk
infliximab hæmmer TNF-α kimærisk
adalimumab hæmmer TNF-α human
ustekinumab blokerer interleukin IL-12 og IL-23 human
basiliximab inhiberer IL-2 på aktiverede T-celler kimærisk
daclizumab inhiberer IL-2 på aktiverede T-celler humaniseret
omalizumab
  • moderat til svær allergisk astma
hæmmer humant immunglobulin E (IgE) humaniseret
Anti-kræft gemtuzumab mål myeloid celleoverfladeantigen CD33leukæmi celler humaniseret
alemtuzumab målretter mod et antigen CD52T- og B-lymfocytter humaniseret
rituximab målretter mod phosphoprotein CD20B -lymfocytter kimærisk
trastuzumab
  • brystkræft med HER2/neu -overekspression
målretter mod HER2/neu (erbB2) -receptoren humaniseret
nimotuzumab EGFR -hæmmer humaniseret
cetuximab EGFR -hæmmer kimærisk
bevacizumab & ranibizumab hæmmer VEGF humaniseret
Anticancer og antiviral bavituximab immunterapi , målretter phosphatidylserin kimærisk
Antiviral

casirivimab/imdevimab

immunterapi , målretter mod protein af SARS-CoV-2 kimærisk
bamlanivimab/etesevimab immunterapi , målretter mod protein af SARS-CoV-2 kimærisk
Andet palivizumab
  • RSV -infektioner hos børn
inhiberer et RSV -fusionsprotein (F) humaniseret
abciximab hæmmer receptoren GpIIb/IIIablodplader kimærisk

Bivirkninger

Flere monoklonale antistoffer, såsom bevacizumab og cetuximab , kan forårsage forskellige slags bivirkninger. Disse bivirkninger kan kategoriseres i almindelige og alvorlige bivirkninger.

Nogle almindelige bivirkninger omfatter:

  • Svimmelhed
  • Hovedpine
  • Allergi
  • Diarré
  • Hoste
  • Feber
  • Kløe
  • Rygsmerte
  • Generel svaghed
  • Mistet appetiten
  • Søvnløshed
  • Forstoppelse

Blandt de mulige alvorlige bivirkninger er:

Se også

Referencer

Yderligere læsning

eksterne links