Luciferase - Luciferase

Dinoflagellat Luciferase katalytisk domæne
krystalstruktur af et luciferase -domæne fra dinoflagellatet Lingulodinium polyedrum
Identifikatorer
Symbol	Luciferase_cat
Pfam	PF10285
InterPro	IPR018804
Tilgængelige proteinstrukturer: Pfam   strukturer / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum strukturresumé

Luciferase er en generisk betegnelse for klassen af ​​oxidative enzymer, der producerer bioluminescens , og skelnes sædvanligvis fra et fotoprotein . Navnet blev først brugt af Raphaël Dubois, der opfandt ordene luciferin og luciferase for henholdsvis enzymet og enzymet . Begge ord stammer fra det latinske ord lucifer , der betyder "lysbærer", som igen stammer fra de latinske ord for "lys" ( lux) og "at bringe eller bære" ( ferre) .

Firefly luciferase
Struktur af Photinus pyralis ildflueluciferase .
Identifikatorer
Organisme	Photinus pyralis
Symbol	Firefly luciferase
PDB	1LCI Flere strukturer
UniProt	P08659
Andre data
EF -nummer	1.13.12.7
Søge efter Strukturer Schweizisk model Domæner InterPro

Luciferases er meget udbredt inden for bioteknologi , til mikroskopi og som reportergener til mange af de samme anvendelser som fluorescerende proteiner . I modsætning til fluorescerende proteiner kræver luciferaser imidlertid ikke en ekstern lyskilde , men kræver tilsætning af luciferin , det forbrugelige substrat.

Eksempler

En række organismer regulerer deres lysproduktion ved hjælp af forskellige luciferaser i en række lysemitterende reaktioner. Størstedelen af ​​undersøgte luciferaser er fundet hos dyr, herunder ildfluer , og mange havdyr, såsom copepods , vandmænd og havmoderblomst . Imidlertid er luciferaser blevet undersøgt i lysende svampe, ligesom Jack-O-Lantern-svampen , samt eksempler i andre kongeriger, herunder lysende bakterier og dinoflagellater .

Ildflue og klikbille

De luciferaser af ildfluer - hvoraf der er over 2000 arter - og den anden Elateroidea (klik biller og slægtninge i almindelighed) er forskellige nok til at være nyttige i molekylær fylogeni . I ildfluer tilføres ilt, der kræves, gennem et rør i maven, der kaldes abdominal luftrør . En velstuderet luciferase er den hos Photinini firefly Photinus pyralis , som har en optimal pH på 7,8.

Havmoderblomst

Også godt undersøgt er havmoderblomst , Renilla reniformis . I denne organisme er luciferase ( Renilla-luciferin 2-monooxygenase ) tæt forbundet med et luciferinbindende protein samt et grønt fluorescerende protein ( GFP ). Calcium udløser frigivelse af luciferin ( coelenterazin ) fra luciferinbindende protein. Substratet er derefter tilgængeligt for oxidation af luciferase, hvor det nedbrydes til coelenteramid med en resulterende frigivelse af energi. I fravær af GFP ville denne energi blive frigivet som en foton af blåt lys (spidsbølgelængde 482 nm). På grund af den tæt forbundne GFP er energien frigivet af luciferase i stedet koblet gennem resonansenergioverførsel til GFP 's fluorofor og frigives efterfølgende som en foton af grønt lys (spidsemissionsbølgelængde 510 nm). Den katalyserede reaktion er:

• coelenterazin + O ₂ → coelenteramid + CO ₂ + foton af lys

Copepod

Nyere luciferaser er for nylig blevet identificeret, der i modsætning til andre luciferaser er naturligt udskillede molekyler. Et sådant eksempel er Metridia coelenterazin -afhængig luciferase (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), der er afledt af den marine copepod Metridia longa . Den Metridia longa secernerede luciferasegenet koder for et 24 kDa protein, der indeholder en N-terminal sekretorisk signal peptid på 17 aminosyrerester rester. Følsomheden og den høje signalintensitet af dette luciferasemolekyle viser sig fordelagtig i mange reporterundersøgelser. Nogle af fordelene ved at bruge et udskilt reportermolekyle som MetLuc er dets no-lysis-protokol, der gør det muligt for en at kunne udføre levende celleassays og flere assays på den samme celle.

Bakteriel

Bakteriel bioluminescens ses i Photobacterium -arter, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi og Vibrio harveyi . Lysemission i nogle bioluminescerende bakterier udnytter 'antenne' såsom lumazin protein at acceptere energi fra den primære anslåede tilstand på luciferase, hvilket resulterer i en ophidset lulnazine kromofor , som udsender lys, der er af en kortere bølgelængde (mere blå), mens det i andre bruge et gult fluorescerende protein (YFP) med FMN som kromofor og udsender lys, der er rødskiftet i forhold til det fra luciferase.

Dinoflagellat

Dinoflagellat luciferase er et eukaryotprotein med flere domæner , der består af et N-terminalt domæne og tre katalytiske domæner , der hver er forud for et spiralformet bundtdomæne. Den struktur af dinoflagellaten luciferase katalytiske domæne er blevet løst. Kernedelen af ​​domænet er en 10 -strenget beta -tønde , der strukturelt ligner lipocaliner og FABP . Det N-terminale domæne bevares mellem dinoflagellat luciferase og luciferinbindende proteiner (LBP'er). Det er blevet foreslået, at denne region kan formidle en interaktion mellem LBP og luciferase eller deres tilknytning til den vakuolære membran. Det spiralformede bundldomæne har en bundning med tre helix -bundter , der rummer fire vigtige histidiner , der menes at spille en rolle i enzymets pH -regulering . Der er en stor lomme i β-tønde i dinoflagellat luciferase ved pH 8 for at rumme tetrapyrrol- substratet, men der er ingen åbning for at tillade substratet at komme ind. Derfor skal der ske en betydelig konformationsændring for at give adgang og plads til en ligand i det aktive sted, og kilden til denne ændring er gennem de fire N-terminale histidinrester. Ved pH 8 kan det ses, at de uprotonerede histidinrester er involveret i et netværk af hydrogenbindinger ved grænsefladen af ​​spiralerne i bundtet, der blokerer substratadgang til det aktive sted og afbrydelse af denne interaktion ved protonation (ved pH 6,3) eller ved udskiftning af histidinresterne med alanin forårsager en stor molekylær bevægelse af bundtet, adskiller spiralerne med 11Å og åbner det katalytiske sted. Logisk set kan histidinresterne ikke erstattes af alanin i naturen, men denne eksperimentelle udskiftning bekræfter yderligere, at de større histidinrester blokerer det aktive sted. Derudover kunne tre Gly-Gly-sekvenser, en i den N-terminale helix og to i helix-loop-helix-motivet, tjene som hængsler, som kæderne roterer om, for yderligere at åbne vejen til det katalytiske sted og forstørre det aktive websted.

En dinoflagellat-luciferase er i stand til at udsende lys på grund af dets interaktion med dets substrat ( luciferin ) og det luciferinbindende protein (LBP) i scintillon- organellen, der findes i dinoflagellater. Luciferasen virker i overensstemmelse med luciferin og LBP for at udsende lys, men hver komponent fungerer ved en anden pH. Luciferase og dets domæner er ikke aktive ved pH 8, men de er ekstremt aktive ved den optimale pH på 6,3, mens LBP binder luciferin ved pH 8 og frigiver det ved pH 6,3. Følgelig frigives luciferin kun for at reagere med en aktiv luciferase, når scintillen syrnes til pH 6,3. Derfor, for at sænke pH, spændingsstyrede kanaler i scintillon membranen åbnes for at tillade optagelse af protoner fra en vacuole besidder en aktionspotentiale fremstillet af en mekanisk stimulering. Derfor kan det ses, at aktionspotentialet i den vakuolære membran fører til forsuring, og dette gør det igen muligt for luciferinet at blive frigivet til at reagere med luciferase i scintillon, hvilket giver et blink af blåt lys.

Reaktionsmekanisme

Alle luciferaser er klassificeret som oxidoreduktaser ( EC 1.13.12.- ), hvilket betyder, at de virker på enkeltdonorer med inkorporering af molekylært oxygen. Fordi luciferaser er fra mange forskellige proteinfamilier , der ikke er relateret, er der ingen samlende mekanisme, da enhver mekanisme afhænger af luciferase- og luciferin -kombinationen. Imidlertid har alle karakteriserede luciferase-luciferinreaktioner til dato vist sig at kræve molekylært oxygen på et eller andet tidspunkt.

Bakteriel luciferase

Reaktionen katalyseret af bakteriel luciferase er også en oxidativ proces:

• FMNH ₂ + O ₂ + RCHO → FMN + RCOOH + H ₂ O + lys

I reaktionen oxiderer molekylært oxygen flavinmononukleotid og et langkædet alifatisk aldehyd til en alifatisk carboxylsyre . Reaktionen danner et ophidset hydroxyflavin-mellemprodukt, som dehydratiseres til produktet FMN for at udsende blågrønt lys.

Næsten al energi, der indsættes i reaktionen, omdannes til lys. Reaktionen er 80% til 90% effektiv. Til sammenligning konverterer glødepæren kun ca. 10% af sin energi til lys, og en 150 lumen pr. Watt (lm/W) LED konverterer 20% af inputenergien til synligt lys.

Ansøgninger

Luciferaser kan produceres i laboratoriet gennem genteknologi til en række formål. Luciferase -gener kan syntetiseres og indsættes i organismer eller transficeres i celler. Fra og med 2002 er mus , silkeorm og kartofler blot nogle få af de organismer, der allerede er konstrueret til at producere proteinet.

I luciferasereaktionen, udsendes lys når luciferase virker på passende luciferin substrat . Fotonemission kan detekteres af lysfølsomme apparater, såsom et luminometer eller modificerede optiske mikroskoper . Dette tillader observation af biologiske processer. Da lys excitation ikke er nødvendig for luciferase bioluminescens, er der minimal autofluorescens og derfor praktisk talt baggrundsfri fluorescens. Derfor kan så lidt som 0,02 pg stadig måles nøjagtigt ved hjælp af en standard scintillationstæller .

I biologisk forskning bruges luciferase sædvanligvis som reporter til at vurdere transkriptionel aktivitet i celler, der transficeres med en genetisk konstruktion indeholdende luciferase -genet under kontrol af en promotor af interesse. Derudover kan proluminescerende molekyler, der omdannes til luciferin ved aktivitet af et bestemt enzym, bruges til at påvise enzymaktivitet i koblede eller totrins luciferase assays. Sådanne substrater er blevet brugt til blandt andet at påvise caspaseaktivitet og cytochrom P450 -aktivitet.

Luciferase kan også anvendes til at påvise niveauet af cellulær ATP i cellelevedygtighedsassays assays eller til kinase aktivitetsassays. Luciferase kan fungere som et ATP -sensorprotein gennem biotinylering . Biotinylering vil immobilisere luciferase på celleoverfladen ved at binde til et streptavidin - biotinkompleks . Dette gør det muligt for luciferase at detektere udstrømningen af ​​ATP fra cellen og vil effektivt vise frigivelse af ATP i realtid gennem bioluminescens. Luciferase kan desuden gøres mere følsom for ATP-ved at øge luminescensintensitet ved at ændre visse aminosyrerester rester i sekvensen af proteinet.

Hele dyrs billeddannelse (kaldet in vivo, når de lever eller på anden måde kaldes ex vivo -billeddannelse) er en kraftfuld teknik til at studere cellepopulationer i levende dyr, såsom mus. Forskellige typer celler (f.eks. Knoglemarvsstamceller, T-celler) kan konstrueres til at udtrykke en luciferase, der tillader deres ikke-invasive visualisering inde i et levende dyr ved hjælp af et følsomt ladningspar-kamera ( CCD-kamera ). Denne teknik er blevet brugt at følge tumorigenese og tumors reaktion på behandling i dyremodeller. Imidlertid kan miljøfaktorer og terapeutiske interferenser forårsage nogle uoverensstemmelser mellem tumorbyrde og bioluminescensintensitet i forhold til ændringer i proliferativ aktivitet. Intensiteten af ​​signalet målt ved in vivo-billeddannelse kan afhænge af forskellige faktorer, såsom D-luciferinabsorption gennem bughinden, blodgennemstrømning, cellemembranpermeabilitet, tilgængelighed af co-faktorer, intracellulær pH og gennemsigtighed af overliggende væv, ud over mængden af ​​luciferase.

Luciferase er et varmefølsomt protein, der bruges i undersøgelser af proteindenaturering , der tester beskyttelseskapaciteten af varmechokproteiner . Mulighederne for at bruge luciferase fortsætter med at udvide.

Se også

• Luciferin
• Bioluminescens billeddannelse
• Kvorumfornemmelse
• Bioluminescerende bakterier

Referencer

eksterne links