N-acylphosphatidylethanolaminspecifik phospholipase D- N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-acylphosphatidylethanolaminphospholipase D ( NAPE-PLD ) er et enzym, der katalyserer frigivelsen af N-acylethanolamin (NAE) fra N-acyl-phosphatidylethanolamin (NAPE). Dette er en vigtig del af processen, der omdanner almindelige lipider til kemiske signaler som anandamid og oleoylethanolamin . Hos mennesker kodes NAPE-PLD-proteinet af NAPEPLD- genet .

Opdagelse

NAPE -PLD er en enzymaktivitet - en phospholipase , der virker på phospholipider, der findes i cellemembranen . Det er ikke homologi men den kemiske resultat af sin aktivitet at klasser det som phospholipase D . Den enzymatiske aktivitet blev opdaget og karakteriseret ved en række eksperimenter, der kulminerede i publikationen fra 2004 af et biokemisk rensningsskema, hvorfra peptidsekventering kunne udføres. Forskere homogeniserede (fintmalet) hjerter fra 150 rotter og udsatte det resulterende rålysat for saccharosesedimentering ved 105.000 xg for at adskille cellemembranerne fra resten af ​​cellen. De integrerede membranproteiner blev derefter solubiliseret under anvendelse af octylglucosid og underkastet fire søjlekromatografitrin (HiTrap SP HP-kationbytterkolonne, HiTrap Q anionbytterkolonne, HiTrap Blue-affinitetssøjle, Bio-Gel HTP-hydroxyapatitkolonne). Hver af disse adskiller de forskellige typer membranproteiner i forskellige prøvebeholdere, når proteinerne elueres fra søjlen over tid, og ved at måle aktiviteten af ​​prøver i hver beholder var det muligt at spore, hvilke der modtog det aktive enzym. Måling af enzymaktiviteten blev udført ved tyndtlagskromatografi af et radioaktivt substrat, der var følsomt for NAPE-PLD-enzymatisk aktivitet: Spaltning af substratet blev påvirket, hvor det optrådte på pladen, da strålingen blev detekteret på en bioimaging-analysator.

Resultatet af denne omfattende procedure var stadig ikke et rent protein, men det producerede et begrænset antal bånd ved hjælp af SDS-PAGE , og et bånd på 46 kilodalton viste sig at korrelere i intensitet med den enzymatiske aktivitet. Dette bånd blev skåret ud af gelen og fordøjet med trypsin , og peptider derfra blev adskilt fra hinanden ved omvendt fase højtydende væskekromatografi . De resulterende fragmenter blev derefter mikrosekventeret ved en automatisk Edman -nedbrydning . Tre svarede til vimentin , et mellemliggende filamentprotein på 56 kDa, der menes at være en kontaminant, og de to andre matchede cDNA-klonen, der efterfølgende blev identificeret som NAPE-PLD.

Når dette spor var opnået, kunne identifikationen bekræftes ved en mindre belastende procedure: Overekspression af det formodede NAPE-PLD-cDNA i COS-7-celler gav en stærk NAPE-PLD-enzymatisk aktivitet, hvis egenskaber viste sig at ligne dem for det originale hjerteekstrakt.

Egenskaber

Den NAPEPLD cDNA -sekvensen forudsiger 396 aminosyresekvenser sekvenser i både mus og rotter, som er 89% og 90% identisk med den for mennesker. NAPE-PLD blev fundet at have nogen homologi med de kendte phospholipase D -gener, men kan klassificeres ved homologi til at falde i zink metallohydrolase familie af beta-lactamase fold . Især blev det stærkt bevarede motiv H X ( E / H ) X D ( C / R / S / H ) X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D ) X _30–70 H observeret, hvilket er generelt forbundet med zinkbinding og hydrolysereaktion i denne proteinklasse, hvilket får forfatterne til at foreslå, at aktivitet skal korreleres med zinkindhold.

Når rekombinant NAPE-PLD blev testet i COS-celler in vitro den havde lignende aktivitet over flere radiomærkede substrater: N-palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine og N-stearoylphosphatidylethanolamine alle reagerede med en K _m mellem 2-4 mikromolær og en V _max mellem 73 og 101 nanomol pr. Milligram i minuttet som beregnet af Lineweaver – Burk plot . (Disse genererer henholdsvis N- palmitoylethanolamin , anandamid , N- oleoylethanolamin og N-stearoylethanolamin) Enzymet reagerede også N-palmitoyl-lyso-phosphatidylethanolamin og N-arachidonoyl-lyso-phosphatidylethanolamin med lignende K _m, men på en tredjedel til en -fjerde V _max . Disse aktiviteter er i overensstemmelse med den observation, at mange væv producerer en række N -acylethanolaminer .

NAPE-PLD havde imidlertid ingen evne til at producere påviselig phosphatidsyre fra phosphatidylcholin eller phosphatidylethanolamin, som katalyseres af andre phospholipase D- enzymer. Det mangler også transphosphatidyleringsaktiviteten af ​​phospholipase D, der tillader dannelse af phosphatidylalkoholer frem for phosphatidinsyre i nærvær af ethanol eller butanol .

Pathway

Dette enzym fungerer som det andet trin i en biokemisk vej, der initieres ved dannelsen af N -acylphosphatidylethanolamin ved hjælp af overførsel af en acylgruppe fra glycerophospholipids sn -position til aminogruppen phosphatidylethanolamin . Mens NAPE-PLD bidrager til biosyntesen af ​​flere NAE'er i pattedyrets centralnervesystem, er det ikke klart, om dette enzym ikke er ansvarligt for dannelsen af endocannabinoid- anandamidet , da NAPE-PLD- knockoutmus er rapporteret at have vildtype niveauer eller meget reducerede niveauer af anandamid.

De N-acylethanolamines frigivet af dette enzym blive potentielle substrater for fedtsyre hydrolase amid (FAAH), der hydrolyserer de frie fedtsyrer fra ethanolamin . Defekter i dette enzym kan få NAPE-PLD-produkter, såsom anandamid, til at bygge op til niveauer 15 gange højere end normalt observeret.

Struktur

Dette membranenzym danner homodimerer , delvist adskilt af en intern ∼9-Å-bred kanal. Den metallo beta-lactamase -protein fold er indrettet til at associere med membran phospholipider . Et hydrofobt hulrum giver en indgangsvej for substratet NAPE ind i det aktive sted, hvor et binukleært zinkcenter katalyserer dets hydrolyse. Galdesyrer binder med høj affinitet til selektive lommer i dette hulrum, hvilket forbedrer dimersamling og muliggør katalyse. NAPE-PLD letter krydsning mellem galdesyresignaler og lipidamidsignaler.

Referencer