Phospholipase D - Phospholipase D

Phospholipase D ( EF 3.1.4.4 , lipophosphodiesterase II , lecithinase D , cholin phosphatase ) ( PLD ) er et enzym af phospholipase superfamilien . Fosfolipaser forekommer bredt og kan findes i en lang række organismer, herunder bakterier, gær, planter, dyr og vira. Phospholipase D's primære substrat er phosphatidylcholin , som det hydrolyserer til frembringelse af signalet molekyle phosphatidsyre (PA), og opløselig cholin i en kolesterol afhængig proces kaldes substrat præsentation . Planter indeholder mange gener, der koder for forskellige PLD -isoenzymer , med molekylvægte fra 90 til 125 kDa . Pattedyrsceller koder for to isoformer af phospholipase D: PLD1 og PLD2 . Phospholipase D er en vigtig spiller i mange fysiologiske processer, herunder membranhandel , cytoskeletal reorganisering, receptormedieret endocytose , exocytose og cellemigration . Gennem disse processer er det blevet yderligere impliceret i patofysiologien ved flere sygdomme : især udviklingen af Parkinsons og Alzheimers samt forskellige kræftformer . PLD kan også hjælpe med at fastsætte tærsklen for følsomhed over for anæstesi og mekanisk kraft.

Opdagelse

PLD-type aktivitet blev først rapporteret i 1947 af Donald J. Hanahan og IL Chaikoff. Det var imidlertid først i 1975, at den hydrolytiske virkningsmekanisme blev belyst i pattedyrsceller . Vegetabilske isoformer af PLD blev først oprenset fra kål og ricinusfrø ; PLDα blev i sidste ende klonet og karakteriseret fra en række forskellige planter, herunder ris, majs og tomat. Plante PLD'er er blevet klonet i tre isoformer: PLDα , PLDβ og PLDγ . Mere end et halvt århundrede med biokemiske undersøgelser har impliceret phospholipase D- og PA -aktivitet i en lang række fysiologiske processer og sygdomme , herunder inflammation , diabetes , fagocytose , neuronal og hjertesignalering og onkogenese .

Fungere

Strengt taget er phospholipase D en transphosphatidylase : den formidler udveksling af polære hovedgrupper kovalent knyttet til membranbundne lipider . Ved hjælp af vand som en nukleofil katalyserer dette enzym spaltningen af phosphodiesterbindingen i strukturelle phospholipider, såsom phosphatidylcholin og phosphatidylethanolamin . Produkterne af denne hydrolyse er membranbundet lipid phosphatidsyre (PA), og cholin , som diffunderer ind i cytosolen . Da cholin har lidt anden messenger -aktivitet, transduceres PLD -aktivitet for det meste ved produktion af PA. PA er stærkt involveret i intracellulær signaltransduktion . Desuden kan nogle medlemmer af PLD- superfamilien anvende primære alkoholer, såsom ethanol eller 1-butanol, ved spaltningen af phospholipidet , hvilket effektivt katalyserer udvekslingen af ​​den polære lipidhovedgruppe . Andre medlemmer af denne familie er i stand til at hydrolysere andre phospholipidsubstrater, såsom cardiolipin , eller endda phosphodiesterbindingen, der udgør rygraden i DNA .

Phosphatidsyre

Mange af phospholipase D's cellulære funktioner medieres af dets hovedprodukt, phosphatidsyre (PA). PA er et negativt ladet phospholipid , hvis lille hovedgruppe fremmer membrankrumning . Det menes således at lette membran - vesikelfusion og fission på en analog måde med clathrin -medieret endocytose . PA kan også rekruttere proteiner, der indeholder dets tilsvarende bindingsdomæne , en region karakteriseret ved basiske aminosyre -rige områder. Derudover kan PA omdannes til en række andre lipider , såsom lysophosphatidsyre (lyso-PA) eller diacylglycerol , signalmolekyler, der har en lang række virkninger på nedstrøms cellulære veje . PA og dets lipid -derivater er impliceret i talrige processer , der omfatter intracellulær vesikeltrafik , endocytose , exocytose , actin cytoskeleton dynamik , celleproliferation differentiering , og migration .

Figur 1. En model for ARF -afhængig aktivering af phospholipase D og et foreslået skema for vesikelendocytose . I denne model aktiverer ARF phospholipase D ( PLD ) og rekrutterer den til plasmamembranen . Hydrolyse af phosphatidylcholin ( PC ) ved hjælp af ARF-aktiveret PLD producerer phosphatidsyre ( PA ). PA rekrutterer efterfølgende molekyler der former indre flade af lipiddobbeltlaget , letter vesikeldannelse . Lokal berigelse af sure phospholipider hjælper med at rekruttere adapterproteiner ( AP ) og belægningsproteiner ( CP ) til membranen , hvilket initierer spiringen af vesiklen . Vesikel fission medieres i sidste ende af dynamin , som i sig selv er en nedstrøms effektor af PA.

Pattedyrs PLD interagerer direkte med kinaser som PKC , ERK , TYK og styrer signalering, der angiver, at PLD aktiveres af disse kinaser. Da cholin er meget rigelig i cellen, påvirker PLD -aktivitet ikke signifikant cholinniveauer, og det er usandsynligt, at cholin spiller nogen rolle i signalering.

Phosphatidsyre er et signalmolekyle og virker til at rekruttere SK1 til membraner . PA er ekstremt kortvarig og hydrolyseres hurtigt af enzymet phosphatidatphosphatase til dannelse af diacylglycerol (DAG). DAG kan også omdannes til PA ved hjælp af DAG -kinase . Selvom PA og DAG er interkonvertible, handler de ikke på samme veje . Stimuli, der aktiverer PLD , aktiverer ikke enzymer nedstrøms for DAG og omvendt.

Det er muligt, at selvom PA og DAG er interkonverterbare, kan separate puljer af signalering og ikke-signalerende lipider opretholdes. Undersøgelser har antydet, at DAG -signalering medieres af flerumættet DAG, mens PLD -afledt PA er enkeltumættet eller mættet . Således kan funktionelt mættet/enkeltumættet PA nedbrydes ved at hydrolysere det til dannelse af ikke-funktionel mættet/enumættet DAG, mens funktionel flerumættet DAG kan nedbrydes ved at omdanne det til ikke-funktionel flerumættet PA.

En lysophospholipase D kaldet autotaxin blev for nylig identificeret som en vigtig rolle i celleproliferation gennem sit produkt, lysophosphatidinsyre (LPA).

Struktur

Plante- og dyre -PLD'er har en konsistent molekylær struktur , kendetegnet ved katalysesteder omgivet af et sortiment af regulatoriske sekvenser . Den aktive sted af plds består af fire stærkt konserverede aminosyresekvenser sekvenser (I-IV), hvoraf motiver II og IV er særligt konserveret. Disse strukturelle domæner indeholder den kendetegnende katalytiske sekvens HxKxxxxD (HKD), hvor H , K og D er aminosyrerne histidin (H), lysin (K), asparaginsyre (D), mens x repræsenterer ikke -konservative aminosyrer . Disse to HKD -motiver giver PLD hydrolytisk aktivitet og er kritiske for dets enzymatiske aktivitet både in vitro og in vivo . Hydrolyse af phosphodiesterbindingen sker, når disse HKD -sekvenser er i den korrekte nærhed .

Humane proteiner, der indeholder dette motiv, omfatter:

• PGS1 , PLD1 , PLD2 , PLD3 , PLD4 , PLD5

PC -hydrolyserende PLD er en homolog af cardiolipinsyntase , phosphatidylserinsyntase , bakterielle PLD'er og virale proteiner . Hver af disse synes at besidde en domæne overlapning som det fremgår af tilstedeværelsen af to HKD motiver indeholdende vel- konserverede histidin , lysin og asparagin rester som kan bidrage til den aktive sted asparaginsyre . En Escherichia coli endonuclease (nuc) og lignende proteiner ser ud til at være PLD -homologer, men besidder kun et af disse motiver.

PLD- gener koder derudover yderst konserverede regulatoriske domæner : phox-konsensus-sekvensen (PX) , pleckstrin-homologidomænet (PH) og et bindingssted for phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP ₂ ).

Katalysemekanisme

PLD- katalyseret hydrolyse er blevet foreslået at forekomme i to trin via en " ping-pong " -mekanisme. I dette skema er de histidin rester af hver HKD motiv successivt angribe den phospholipid substrat . Funktionerende som nukleofiler danner de bestanddeler imidazol- grupper af histidinerne forbigående kovalente bindinger med phospholipidet , hvilket producerer et kortvarigt mellemprodukt , der let kan hydrolyseres af vand i et efterfølgende trin .

Substratpræsentation ; PLD (blå oval) udskilles i kolesterolafhængige lipiddomæner (grønne lipider) ved palmitoylering . PLD binder også PIP2 (rød sekskant) domæner (grå skygge) placeret i cellens uordnede område med phosphatidylcholin (PC). Når PIP2 stiger i cellen, translokerer PLD til PIP2, hvor den udsættes for og hydroliserer PC til phosphatidsyre (rødt sfærisk lipid).

Aktiveringsmekanisme

Substratpræsentation For PLD2 hos pattedyr er det molekylære grundlag for aktivering substratpræsentation. Enzymet er inaktivt i lipidmikrodomæner rige på sphingomyelin og udtømt af PC-substrat. Øget PIP2 eller et fald i kolesterol får enzymet til at translokere til PIP2 mikrodomæner nær dets substrat -PC. Derfor aktiveres PLD -dåsen primært ved lokalisering inden i plasmamembranen frem for en proteinkonformationsændring. Afbrydelse af lipiddomæner ved anæstetika. eller mekanisk kraft. Proteinet kan også undergå en konformationsændring ved PIP2 -binding, men dette er ikke blevet vist eksperimentelt og ville udgøre en aktiveringsmekanisme, der adskiller sig fra substratpræsentation.

Isoformer

To store isoformer af phospholipase D er blevet identificeret i pattedyrceller : PLD1 og PLD2 (53% sekvenshomologi ), hver kodet af forskellige gener . PLD -aktivitet ser ud til at være til stede i de fleste celletyper med de mulige undtagelser for perifere leukocytter og andre lymfocytter . Begge PLD -isoformer kræver PIP ₂ som en kofaktor for aktivitet . PLD1 og PLD2 udviser forskellige subcellulære lokaliseringer, der dynamisk ændrer sig i løbet af signaltransduktion . PLD -aktivitet er blevet observeret i plasmamembranen , cytosol , ER og Golgi -komplekset .

PLD1

PLD1 er et 120 kDa protein, der hovedsageligt er placeret på cellens indre membraner . Det er primært til stede på Golgi -komplekset , endosomer , lysosomer og sekretoriske granuler . Efter binding af en ekstracellulær stimulus, pLD1 er transporteret til plasmamembranen . Basal pLD1 aktivitet er lav dog, og for at transducere den ekstracellulære signal, skal det først aktiveres af proteiner såsom ARF , Rho , Rac og proteinkinase C .

Regulering

Aktiviteten af ​​phospholipase D er omfattende reguleret af hormoner , neurotransmittere , lipider , små monomere GTPaser og andre små molekyler, der binder til deres tilsvarende domæner på enzymet. I de fleste tilfælde, signaltransduktion medieres gennem produktion af phosphatidsyre , der fungerer som en sekundær messenger .

Specifikke phospholipider er regulatorer af PLD -aktivitet i plante- og dyreceller. De fleste PLD'er kræver phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP ₂ ), som en kofaktor for aktivitet. PIP ₂ og andre phosphoinositider er vigtige modifikatorer af cytoskeletdynamik og membrantransport og kan trafikere PLD til dens substrat -pc. PLD'er reguleret af disse phospholipider er almindeligt involveret i intracellulær signaltransduktion . Deres aktivitet er afhængig af bindingen af ​​disse phosphoinositider nær det aktive sted . Hos planter og dyr er dette bindingssted karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​en bevaret sekvens af basiske og aromatiske aminosyrer . I planter som Arabidopsis thaliana udgør denne sekvens et RxxxxxKxR -motiv sammen med dens omvendte gentagelse , hvor R er arginin og K er lysin . Dens nærhed til det aktive sted sikrer højt niveau af pLD1 og PLD2 aktivitet og fremmer translokation af pLD1 til target -membraner som reaktion på ekstracellulære signaler.

C2 domæne

Calcium fungerer som en cofaktor i PLD -isoformer, der indeholder C2 -domænet . Binding af Ca ²⁺ til C2-domænet fører til konformationsændringer i enzymet, der styrker enzymsubstratbinding , samtidig med at det svækker forbindelsen til phosphoinositider . I nogle plante isoenzymer , såsom PLDβ , Ca ²⁺ kan binde direkte til den aktive sted , indirekte øge sin affinitet for substratet ved at styrke bindingen af aktivatoren PIP ₂ .

PX -domæne

Det antages, at pbox-konsensussekvensen (PX) formidler bindingen af ​​yderligere phosphatidylinositolfosfater, især phosphatidylinositol 5-phosphat (PtdIns5P), et lipid, der menes at være påkrævet for endocytose , kan hjælpe med at lette reinternaliseringen af PLD1 fra plasmamembranen .

PH domæne

Det stærkt konserverede Pleckstrin -homologidomæne (PH) er et strukturelt domæne med en længde på cirka 120 aminosyrer . Det binder phosphatidylinositider, såsom phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphat (PIP ₃ ) og phosphatidylinositol (4,5) -bisphosphat (PIP ₂ ). Det kan også binde heterotrimeriske G-proteiner via deres βγ-underenhed . Binding til dette domæne menes også at lette re-internaliseringen af proteinet ved at øge dets affinitet til endocytotiske lipidflåder .

Interaktioner med små GTPaser

I animalske celler, små proteinmolekyler faktorer er vigtige yderligere regulatorer af PLD-aktivitet. Disse små monomere GTPaser er medlemmer af Rho- og ARF -familierne i Ras -superfamilien . Nogle af disse proteiner, såsom Rac1 , Cdc42 , og RhoA , allosterisk aktivere mammal pLD1 , direkte øge dets aktivitet. Især translokation af cytosolisk ADP-ribosyleringsfaktor (ARF) til plasmamembranen er afgørende for PLD-aktivering.

Fysiologiske og patofysiologiske roller

Alkoholforgiftning

Phospholipase D metaboliserer ethanol til phosphatidylethanol (PEtOH) i en proces kaldet transphosphatidylering. Ved hjælp af fluegenetik viste det sig, at PEtOH formidler alkoholens hyperaktive reaktion i frugtfluer. Og ethanoltransphosphatidylering viste sig at være opreguleret hos alkoholikere og familiemedlemmer af alkoholikere. S Denne ethanoltransphosphatidyleringsmekanisme opstod for nylig som en alternativ teori for alkoholens virkning på ionkanaler. Mange ionkanaler reguleres af anioniske lipider. og konkurrencen mellem PEtOH og endogene signaleringslipider menes at formidle ethanols virkning på ionkanaler i nogle tilfælde og ikke direkte binding af den frie ethanol til kanalen.

Mekanosensation

PLD2 er en mekanosensor og direkte følsom over for mekanisk afbrydelse af klyngede GM1 -lipider. Mekanisk afbrydelse (væskeskær) signalerer derefter for cellen at differentiere. PLD2 aktiverer også TREK-1 kanaler, en kaliumkanal i den smertestillende vej.

Ved kræft

Phospholipase D er en regulator af flere kritiske cellulære processer, herunder vesikeltransport , endocytose , exocytose , cellemigration og mitose . Dysregulering af disse processer er almindelig i carcinogenese , og til gengæld har abnormiteter i PLD -ekspression været impliceret i udviklingen af flere typer kræft . En chauffør mutation giver forhøjet PLD2 aktivitet er blevet bemærket i flere maligne brystcancere . Forhøjet PLD -ekspression er også blevet korreleret med tumorstørrelse i kolorektal carcinom , gastrisk carcinom og nyrekræft . Imidlertid er de molekylære veje, gennem hvilke PLD driver kræftprogression, uklare. En potentiel hypotese spiller en afgørende rolle for phospholipase D i aktiveringen af mTOR , en suppressor af kræftcelle -apoptose . PLDs evne til at undertrykke apoptose i celler med forhøjet tyrosinkinaseaktivitet gør det til en kandidat -onkogen i kræftformer, hvor sådan ekspression er typisk.

Ved neurodegenerative sygdomme

Phospholipase D kan også spille en vigtig patofysiologisk rolle i udviklingen af neurodegenerative sygdomme , primært gennem dets kapacitet som signaltransducer i uundværlige cellulære processer som cytoskeletal reorganisering og vesikelhandel . Dysregulering af PLD med proteinet a-synuclein har vist sig at føre til det specifikke tab af dopaminerge neuroner hos pattedyr . α-synuclein er den primære strukturelle komponent i Lewy-kroppe , proteinaggregater, der er kendetegnende for Parkinsons sygdom . Inhibering af PLD med α-synuclein kan bidrage til Parkinsons skadelige fænotype .

Unormal PLD-aktivitet er også blevet mistænkt ved Alzheimers sygdom , hvor det er blevet observeret at interagere med presenilin 1 (PS-1), hovedkomponenten i γ-sekretasekomplekset , der er ansvarlig for den enzymatiske spaltning af amyloidprækursorprotein (APP). Ekstracellulære plaketter af produktet β-amyloid er et definerende træk ved Alzheimers syge hjerner. Handling af pLD1 på PS-1 har vist sig at påvirke intracellulær trafik af amyloid precursor til dette kompleks . Phospholipase D3 (PLD3), et ikke-klassisk og dårligt karakteriseret medlem af PLD- superfamilien , har også været forbundet med patogenesen af denne sygdom.

Galleri

• 

  Phosphatidylcholin

• 

  Phosphatidat

• 

  Choline

• 

  Phospholipase -spaltningssteder

Referencer

eksterne links

• Phospholipase+D på US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)