Polyklonale antistoffer - Polyclonal antibodies

Denne artikel handler om produktion af antistoffer in vivo. Se Antiserum for medicinske og biologiske anvendelser .

Polyklonale antistoffer (pAbs) er antistoffer , der udskilles af forskellige B- cellelinjer i kroppen (hvorimod monoklonale antistoffer kommer fra en enkelt cellelinie). De er en samling af immunglobulinmolekyler , der reagerer mod et specifikt antigen , der hver identificerer en anden epitop .

Produktion

Den generelle procedure til fremstilling af polyklonale antistoffer er som følger:

  1. Antigen forberedelse
  2. Adjuvant udvælgelse og forberedelse
  3. Udvælgelse af dyr
  4. Injektionsproces
  5. Ekstraktion af blodserum

Et antigen / adjuvans-konjugat injiceres i et dyr efter eget valg for at initiere et amplificeret immunrespons. Efter en række injektioner over en bestemt tidsperiode forventes dyret at have skabt antistoffer mod konjugatet. Blod ekstraheres derefter fra dyret og renses derefter for at opnå antistoffet af interesse.

Inokulering udføres på et passende pattedyr , såsom en mus, kanin eller ged. Større pattedyr foretrækkes ofte, da mængden af serum, der kan opsamles, er større. Et antigen injiceres i pattedyret. Dette inducerer B- lymfocytterne til at producere IgG- immunglobuliner, der er specifikke for antigenet. Dette polyklonale IgG oprenses fra pattedyrets serum .

Derimod stammer monoklonale antistoffer fra en enkelt cellelinje.

Der findes mange metoder til produktion af polyklonalt antistof i forsøgsdyr. Institutionelle retningslinjer for anvendelse af dyr og procedurer i forbindelse med disse metoder er generelt orienteret omkring humane overvejelser og passende adfærd for adjuvans (midler, der ændrer virkningen af ​​andre stoffer, mens de har få, hvis nogen direkte virkninger, når de gives af sig selv). Dette inkluderer adjuvans selektion, administrationsveje og indgivelsessteder, injektionsvolumener pr. Sted og antal steder pr. Dyr. Institutionelle politikker inkluderer generelt tilladte mængder blod pr. Indsamling og sikkerhedsforanstaltninger, herunder passende tilbageholdenhed og sedation eller bedøvelse af dyr til forebyggelse af skader på dyr eller personale.

Det primære mål med antistofproduktion i forsøgsdyr er at opnå antisera med høj titer , høj affinitet til anvendelse i eksperimenterende eller diagnostiske tests. Hjælpestoffer anvendes til at forbedre eller forbedre et immunrespons over for antigener. De fleste adjuvanser tilvejebringer et antigen-depot på et injektionssted, der muliggør en langsom frigivelse af antigen i drænet lymfeknuder.

Mange hjælpestoffer indeholder eller fungerer også direkte som:

  1. overfladeaktive stoffer, som fremmer koncentration af proteinantigenmolekyler over et stort overfladeareal, og
  2. immunstimulerende molekyler eller egenskaber. Hjælpestoffer anvendes generelt med opløselige proteinantigener til at øge antistoftitre og inducere et forlænget respons med ledsagende hukommelse.

Sådanne antigener er i sig selv generelt dårlige immunogener. De fleste komplekse proteinantigener inducerer flere B-cellekloner under immunresponset, og responset er således polyklonalt. Immunsvar på ikke-proteinantigener er generelt dårligt eller forbedret af hjælpestoffer, og der er ingen systemhukommelse.

Antistoffer produceres i øjeblikket også fra isolering af humane B-lymfocytter til dannelse af specifikke rekombinante monoklonale antistofblandinger. Bioteknologivirksomheden Symphogen udvikler denne type antistoffer til terapeutiske anvendelser. De er det første forskningsfirma, der når fase to-forsøg med de monoklonale antistofblandinger, der efterligner mangfoldigheden af ​​de polyklonale antistoflægemidler. Denne produktion forhindrer viral og prion transmission, og dette er den enkle proces.

Udvælgelse af dyr

Dyr, der ofte anvendes til produktion af polyklonalt antistof, indbefatter kyllinger, geder, marsvin, hamstere, heste, mus, rotter og får. Kaninen er dog det mest anvendte forsøgsdyr til dette formål. Udvælgelse af dyr skal baseres på:

  1. den nødvendige mængde antistof,
  2. forholdet mellem donor af antigenet og modtagerantistofproducenten (generelt jo mere fjernt det fylogenetiske forhold, jo større er potentialet for antistofrespons med høj titer) og
  3. de nødvendige karakteristika [f.eks. klasse, underklasse (isotype), komplementfikserende natur] af de antistoffer, der skal fremstilles. Immunisering og flebotomier er associeret med stress, og i det mindste ved anvendelse af kaniner og gnavere foretrækkes specifikke patogenfrie (SPF) dyr. Anvendelse af sådanne dyr kan dramatisk reducere sygelighed og dødelighed på grund af patogene organismer, især Pasteurella multocida hos kaniner.

Geder eller heste bruges generelt, når der kræves store mængder antisera. Mange efterforskere foretrækker kyllinger på grund af deres fylogenetiske afstand fra pattedyr. Kyllinger overfører store mængder IgY (IgG) til æggeblommen, og høst af antistoffer fra æg eliminerer behovet for den invasive blødningsprocedure. En uges æg kan indeholde 10 gange flere antistoffer end volumenet af kaninblod opnået ved en ugentlig blødning. Der er dog nogle ulemper, når man bruger visse kyllingeafledte antistoffer i immunoanalyser. Kylling IgY fikserer ikke pattedyrs komplementkomponent C1, og det fungerer ikke som et udfældende antistof ved anvendelse af standardopløsninger.

Selvom mus hyppigst anvendes til monoklonal antistofproduktion, forhindrer deres lille størrelse normalt deres anvendelse i tilstrækkelige mængder polyklonale serumantistoffer. Imidlertid kan polyklonale antistoffer i mus opsamles fra ascitesvæske under anvendelse af en hvilken som helst af et antal ascitesproducerende metoder.

Når der anvendes kaniner, skal unge voksne dyr (2,5-3,0 kg eller 5,5-6,5 kg) anvendes til primær immunisering på grund af det kraftige antistofrespons. Immunfunktionstoppe ved puberteten, og primære reaktioner på nye antigener falder med alderen. Kvindelige kaniner foretrækkes generelt, fordi de er mere føjelige og rapporteres at have et mere kraftigt immunrespons end mænd. Mindst to dyr pr. Antigen skal anvendes, når der anvendes opdrættede dyr. Dette princip reducerer potentiel total fiasko som følge af manglende respons på antigener fra individuelle dyr.

Antigenpræparat

Størrelsen, omfanget af aggregering og den relative nativitet af proteinantigener kan alle dramatisk påvirke kvaliteten og kvantiteten af ​​produceret antistof. Små polypeptider (<10 ku ) og ikke-proteinantigener skal generelt konjugeres eller tværbindes til større, immunogene bærerproteiner for at øge immunogeniciteten og tilvejebringe T- celleepitoper. Generelt, jo større det immunogene protein er, desto bedre. Større proteiner, selv i mindre mængder, resulterer sædvanligvis i bedre indgreb af antigenpræsenterende antigenbehandlingsceller for et tilfredsstillende immunrespons. Injektion af opløselige, ikke-aggregerede proteiner har større sandsynlighed for at inducere tolerance snarere end et tilfredsstillende antistofrespons.

Keyhole limpet hemocyanin (KLH) og bovint serumalbumin er to meget anvendte bærerproteiner. Poly-L-lysin er også blevet anvendt med succes som rygrad til peptider. Selvom anvendelsen af ​​Poly-L-lysin reducerer eller eliminerer produktion af antistoffer mod fremmede proteiner, kan det resultere i svigt af peptidinduceret antistofproduktion. For nylig er liposomer også med succes blevet anvendt til levering af små peptider, og denne teknik er et alternativ til levering med olieagtige emulsionshjælpestoffer.

Antigenmængde

Udvælgelse af antigenmængde til immunisering varierer med egenskaberne af antigenet og den valgte adjuvans. Generelt er mikrogram til milligram-mængder protein i adjuvans nødvendige for at fremkalde højtiter-antistoffer. Antigendosering er generelt art, snarere end kropsvægt, forbundet. Det såkaldte "vindue" for immunogenicitet i hver art er bredt, men for meget eller for lidt antigen kan inducere tolerance, undertrykkelse eller immunafvigelse mod cellulær immunitet snarere end et tilfredsstillende humoralt respons. Optimale og sædvanlige proteinantigenniveauer til immunisering af specifikke arter er rapporteret i følgende intervaller:

  1. kanin, 50-1000 µg;
  2. mus, 10–50 µg;
  3. marsvin, 50-500 µg; og
  4. ged, 250–5000 µg.

Optimale "priming" -doser rapporteres at være i den lave ende af hvert interval.

Affiniteten af ​​serumantistoffer stiger med tiden (måneder) efter injektion af antigen-adjuvansblandinger, og når antigenet i systemet falder. Antigendoser, der er meget anvendte til "booster" eller sekundære immuniseringer, er normalt halvdelen til at svare til primingdoseringerne. Antigener skal være fri for præparative biprodukter og kemikalier såsom polyacrylamidgel, SDS, urinstof, endotoksin, partikler og ekstreme pH-værdier.

Peptidantistoffer

Når et peptid bruges til at generere antistoffet, er det ekstremt vigtigt at designe antigenerne korrekt. Der er flere ressourcer, der kan hjælpe med designet såvel som virksomheder, der tilbyder denne service. Expasy har samlet et sæt offentlige værktøjer under sin ProtScale- side, der kræver en vis grad af brugerviden for at navigere. For et mere simpelt peptidscoringsværktøj er der et Antigen Profiler- værktøj til rådighed, der gør det muligt for dig at score individuelle peptidsekvenser baseret på en relationsepitop-kortlægningsdatabase over tidligere immunogener, der blev brugt til at generere antistoffer. Endelig skal peptider som hovedregel følge nogle grundlæggende kriterier.

Når man undersøger peptider til syntese og immunisering, anbefales det, at visse rester og sekvenser undgås på grund af potentielle synteseproblemer. Dette inkluderer nogle af de mere almindelige egenskaber:

  • Ekstremt lange gentagelser af den samme aminosyre (f.eks. RRRR)
  • Serin (S), Threonin (T), Alanin (A) og Valine (V) dubler
  • Afslutning eller start af en sekvens med en prolin (P)
  • Glutamin (Q) eller asparagin (N) ved n-terminalen
  • Peptider overvægtet med hydrofobe rester (f.eks. V, A, L, I osv ...)

Reaktivitet

Undersøgere bør også overveje status for nativitet af proteinantigener, når de anvendes som immunogener og reaktion med producerede antistoffer. Antistoffer mod native proteiner reagerer bedst med native proteiner, og antistoffer mod denaturerede proteiner reagerer bedst med denaturerede proteiner. Hvis der skal fremkaldes antistoffer på membranblots (proteiner udsat for denatureringsbetingelser), skal antistoffer fremstilles mod denaturerede proteiner. På den anden side, hvis antistoffer skal anvendes til at reagere med et naturligt protein eller blokere et proteinaktivt sted, skal der dannes antistoffer mod det native protein. Hjælpestoffer kan ofte ændre proteinets fødsel. Generelt bevarer absorberede proteinantigener i en præformet olie-i-vand- emulsionsadjuvans større nativ proteinstruktur end dem i vand-i-olie-emulsioner.

Asepticitet

Antigener skal altid fremstilles ved hjælp af teknikker, der sikrer, at de er fri for mikrobiel kontaminering. De fleste proteinantigenpræparater kan steriliseres ved passage gennem et 0,22 μm filter. Septiske abscesser forekommer ofte på dyrs inokulationssteder, når der anvendes forurenede præparater. Dette kan resultere i svigt af immunisering mod det målrettede antigen.

Hjælpestoffer

Der er mange kommercielt tilgængelige immunologiske adjuvanser . Valg af specifikke adjuvanser eller typer varierer afhængigt af, om de skal anvendes til forskning og antistofproduktion eller til vaccineudvikling. Hjælpestoffer til vaccineanvendelse behøver kun at producere beskyttende antistoffer og god systemisk hukommelse, mens de til antiserumproduktion har brug for hurtigt at inducere antistoffer med høj titer og høj aviditet. Ingen enkelt adjuvans er ideel til alle formål, og alle har fordele og ulemper. Adjuvant anvendelse ledsages generelt af uønskede bivirkninger af varierende sværhedsgrad og varighed. Forskning på nye hjælpestoffer fokuserer på stoffer, der har minimal toksicitet, mens de bibeholder maksimal immunstimulering. Efterforskere bør altid være opmærksomme på potentiel smerte og lidelse forbundet med adjuverende anvendelse hos forsøgsdyr.

De hyppigst anvendte adjuvanser til antistofproduktion er Freund's, Alum, Ribi Adjuvant System og Titermax.

Freunds hjælpestoffer

Der er to grundlæggende typer af Freunds hjælpestoffer : Freunds komplette hjælpestof (FCA) og Freunds ufuldstændige hjælpestof (FIA). FCA er en vand-i-olie-emulsion, der lokaliserer antigen i frigivelsesperioder op til 6 måneder. Det er formuleret med mineralolie, det overfladeaktive mannidmonoleat og varmedræbte Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium butyricum eller deres ekstrakter (til sammenlægning af makrofager på podningsstedet). Denne potente adjuvans stimulerer både cellemedieret og humoral immunitet med præferenceinduktion af antistof mod epitoper af denaturerede proteiner. Selvom FCA historisk har været den mest anvendte adjuvans, er det et af de mere giftige stoffer på grund af ikke-metaboliserbar mineralolie, og det inducerer granulomatiske reaktioner. Dens anvendelse er begrænset til forsøgsdyr, og den bør kun bruges med svage antigener. Det bør ikke bruges mere end én gang i et enkelt dyr, da flere FCA-inokulationer kan forårsage alvorlige systemiske reaktioner og nedsat immunrespons. Freunds ufuldstændige hjælpestof har den samme formulering som FCA, men indeholder ikke mycobacterium eller dets komponenter. FIA er normalt begrænset til boosterdoser af antigen, da det normalt er meget mindre effektivt end FCA til primær antistofinduktion. Freunds adjuvanser blandes normalt med lige store dele af antigenpræparater til dannelse af stabile emulsioner.

Ribi adjuvanssystem

Ribi-adjuvanser er olie-i-vand-emulsioner, hvor antigener blandes med små volumener af en metaboliserbar olie (squalen), som derefter emulgeres med saltvand indeholdende det overfladeaktive middel Polysorbate 80. Dette system indeholder også raffinerede mycobakterielle produkter (ledningsfaktor, cellevægsskelet) som immunstimulerende midler og bakteriel monophosphoryl-lipid A. Tre forskellige artsorienterede formuleringer af adjuvanssystemet er tilgængelige. Disse adjuvanser interagerer med membraner af immunceller, hvilket resulterer i cytokininduktion, hvilket forbedrer antigenoptagelse, behandling og præsentation. Dette adjuvanssystem er meget mindre toksisk og mindre potent end FCA, men inducerer generelt tilfredsstillende mængder af højaviditetsantistoffer mod proteinantigener.

Titermax

Titermax repræsenterer en nyere generation af hjælpestoffer, der er mindre giftige og ikke indeholder biologisk afledte materialer. Det er baseret på blandinger af overfladeaktivt virkende, lineære, blokke eller kæder af ikke-ioniske copolymerer polyoxypropylen (POP) og polyoxyethylen (POE). Disse copolymerer er mindre toksiske end mange andre overfladeaktive stoffer og har potente adjuvansegenskaber, som favoriserer kemotaxis, komplementaktivering og antistofproduktion. Titermax-adjuvans danner en mikropartikelformet vand-i-olie-emulsion med en copolymer og metaboliserbar squalenolie. Copolymeren er belagt med emulsionsstabiliserende silicapartikler, som muliggør inkorporering af store mængder af en lang række antigene materialer. Den adjuvans aktive copolymer danner hydrofile overflader, som aktiverer komplement, immunceller og øget ekspression af klasse II-hovedhistokompatibilitetsmolekyler på makrofager. Titermax præsenterer antigen i en stærkt koncentreret form over for immunsystemet, hvilket ofte resulterer i antistoftitere, der er sammenlignelige med eller højere end FCA.

Specol : Specol er et vand i olie- adjuvans lavet af renset mineralolie . Det er rapporteret at inducere immunrespons, der kan sammenlignes med Freunds adjuvans hos kanin og andre forskningsdyr, mens de producerer færre histologiske læsioner.

Farmaceutiske anvendelser

Digoxin Immune Fab er det antigenbindende fragment af polyklonale antistoffer rejst til Digitalis- derivat som et hapten bundet til et protein og bruges til at vende om livstruende digoxin- eller digitoxintoksicitet .

Rho (D) immunglobulin er fremstillet af samlet humant plasma forsynet af Rh-negative donorer med antistoffer mod D-antigenet. Det bruges til at tilvejebringe passiv immunbinding af antigen, hvilket forhindrer en moderlig immunrespons, som potentielt kan resultere i hæmolytisk sygdom hos den nyfødte .

Rozrolimupab er det anti- RhD rekombinante humane polyklonale antistof sammensat af 25 unikke IgG1- antistoffer og anvendes til behandling af immun trombocytopeni purpura og forebyggelse af isoimmunisering hos Rh-negative gravide kvinder.

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ) - potentiel behandling for mennesker med COVID-19 og for at forhindre SARS-CoV-2 coronavirusinfektion.

Fordele

Anvendelsen af ​​polyklonale antistoffer (PAbs) frem for monoklonale antistoffer har sine fordele. De tekniske færdigheder, der er nødvendige for at producere polyklonale antistoffer, er ikke så krævende. De er billige at fremstille og kan genereres temmelig hurtigt og tager op til flere måneder at producere. PAbs er heterogene, hvilket gør det muligt for dem at binde til en bred vifte af antigenepitoper. Fordi PAbs er produceret af et stort antal B-cellekloner, er det mere sandsynligt, at de med succes binder til et specifikt antigen. PAbs forbliver stabile i forskellige miljøer, såsom en ændring i pH eller saltkoncentration, hvilket gør det muligt for dem at være mere anvendelige i visse procedurer. Derudover kan PAbs fremstilles i store mængder afhængigt af den nødvendige mængde i forhold til størrelsen på det anvendte dyr.

Se også

Referencer

eksterne links