Gelelektroforese af proteiner - Gel electrophoresis of proteins

Proteiner adskilt af SDS-PAGE , Coomassie Brilliant Blue- farvning

Proteinelektroforese er en metode til analyse af proteiner i en væske eller et ekstrakt. Elektroforesen kan udføres med en lille mængde prøve på en række alternative måder med eller uden et understøttende medium: SDS-polyacrylamidgelelektroforese (kort sagt: gelelektroforese, PAGE eller SDS-elektroforese), fristrømselektroforese , elektrofokusering , isotakoforese , affinitetselektroforese , immunoelektroforese , modelektroforese og kapillærelektroforese . Hver metode har mange variationer med individuelle fordele og begrænsninger. Gelelektroforese udføres ofte i kombination med elektroblotting immunoblotting for at give yderligere oplysninger om et specifikt protein. På grund af praktiske begrænsninger er proteinelektroforese generelt ikke egnet som en forberedende metode.

Denaturerende gelmetoder

SDS-SIDE

SDS-PAGE, natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese , beskriver en samling relaterede teknikker til adskillelse af proteiner i henhold til deres elektroforetiske mobilitet (en funktion af molekylvægten af en polypeptidkæde) i denatureret (udfoldet) tilstand. I de fleste proteiner giver bindingen af SDS til polypeptidkæden en jævn fordeling af ladning pr. Masseenhed, hvilket resulterer i en fraktionering af omtrentlig størrelse under elektroforese.

SDS er et stærkt vaskemiddel, der bruges til at denaturere native proteiner til udfoldede, individuelle polypeptider . Når en proteinblanding opvarmes til 100 ° C i nærvær af SDS, ombrydes vaskemidlet omkring polypeptidskelettet. I denne proces bliver de iboende ladninger af polypeptider ubetydelige i sammenligning med de negative ladninger, som SDS bidrager med. Således bliver polypeptider efter behandling til stavlignende strukturer, der har en ensartet ladningstæthed, der er den samme netto negative ladning pr. Længdeenhed. Disse proteiners elektroforetiske mobilitet vil være en lineær funktion af logaritmerne for deres molekylvægte.

Indfødte gelmetoder

Indfødte geler, også kendt som ikke-denaturerende geler, analyserer proteiner, der stadig er i deres foldede tilstand. Således afhænger den elektroforetiske mobilitet ikke kun af ladning-til-masse-forholdet, men også af proteinets fysiske form og størrelse.

Blå indfødt SIDE

BN-PAGE er en native PAGE- teknik, hvor Coomassie Brilliant Blue- farvestoffet tilfører proteinkomplekserne de nødvendige ladninger til den elektroforetiske adskillelse. Ulempen ved Coomassie er, at den ved binding til proteiner kan virke som et vaskemiddel, der får komplekser til at dissocieres . En anden ulempe er den potentielle slukning af kemoluminescens (f.eks. I efterfølgende western blot -detektering eller aktivitetsassays) eller fluorescens af proteiner med protesegrupper (f.eks. Hæm eller chlorophyll ) eller mærket med fluorescerende farvestoffer.

Ryd indfødt SIDE

CN-PAGE (almindeligvis benævnt Native PAGE) adskiller sure vandopløselige og membran -proteiner i en polyacrylamid gradientgel. Det bruger ikke ladet farvestof, så den elektroforetiske mobilitet af proteiner i CN-PAGE (i modsætning til ladningskiftteknikken BN-PAGE) er relateret til proteinernes egenladning. Migrationsafstanden afhænger af proteinladningen, dens størrelse og porens størrelse af gelen. I mange tilfælde har denne metode lavere opløsning end BN-PAGE, men CN-PAGE giver fordele, når Coomassie- farvestof ville forstyrre yderligere analytiske teknikker, for eksempel er den blevet beskrevet som en meget effektiv mikroskala-separationsteknik til FRET- analyser. CN-PAGE er også mildere end BN-PAGE, så det kan bevare labile supramolekylære samlinger af membranproteinkomplekser , der dissocieres under betingelserne for BN-PAGE.

Kvantitativ indfødt SIDE

De foldede proteinkomplekser af interesse adskiller sig rent og forudsigeligt på grund af de specifikke egenskaber ved polyacrylamidgelen. De adskilte proteiner elueres kontinuerligt til et fysiologisk eluent og transporteres til en fraktionsopsamler. I fire til fem PAGE-fraktioner hver kan metalkofaktorerne identificeres og absolut kvantificeres ved højopløselig ICP-MS . De respektive strukturer af de isolerede metalloproteiner kan bestemmes ved opløsning NMR -spektroskopi.

Buffersystemer

Postuleret migration af proteiner i et Laemmli -gelsystem A: Stabelgel, B: Opløsende gel, o: prøvepåføring c: diskontinuiteter i bufferen og elektroforetisk matrix

De fleste proteinseparationer udføres ved hjælp af et "diskontinuerligt" (eller DISC) buffersystem , der væsentligt øger skarpheden af båndene i gelen. Under elektroforese i et diskontinuerligt gelsystem dannes en iongradient i den tidlige fase af elektroforese, der får alle proteiner til at fokusere til et enkelt skarpt bånd. Dannelsen af iongradienten opnås ved at vælge en pH-værdi, hvor ionerne i bufferen kun er moderat ladet i forhold til de SDS-belagte proteiner. Disse forhold tilvejebringer et miljø, hvor Kohlrauschs reaktioner bestemmer den molære ledningsevne . Som et resultat koncentreres SDS-belagte proteiner til flere gange i en tynd zone i størrelsesordenen 19 um inden for få minutter. På dette trin migrerer alle proteiner med den samme migrationshastighed ved isotachoforese . Dette sker i et område af gelen, der har større porer, så gelmatrixen ikke forsinker migrationen under fokuserings- eller "stablings" -hændelsen. Adskillelse af proteinerne efter størrelse opnås i den nedre, "opløselige" region af gelen. Opløsningsgelen har typisk en meget mindre porestørrelse, hvilket fører til en sigtende effekt, der nu bestemmer proteinernes elektroforetiske mobilitet. På samme tid har den separerende del af gelen også en pH-værdi, hvor bufferionerne i gennemsnit bærer en større ladning, hvilket får dem til at "løbe ud" af de SDS-dækkede proteiner og eliminere iongradienten og derved stablingseffekten.

Et meget udbredt diskontinuerligt buffersystem er tris-glycin- eller " Laemmli " -systemet, der stabler ved en pH-værdi på 6,8 og løser sig ved en pH-værdi på ~ 8,3-9,0. En ulempe ved dette system er, at disse pH-værdier kan fremme dannelse af disulfidbinding mellem cysteinrester i proteinerne, fordi pKa af cystein varierer fra 8-9, og fordi reduktionsmiddel, der er til stede i ladningsbufferen, ikke co-migrerer med proteinerne. Nylige fremskridt inden for bufferingsteknologi afhjælper dette problem ved at opløse proteiner ved en pH-værdi langt under cysteinens pKa (f.eks. Bis-tris , pH 6,5) og omfatte reduktionsmidler (f.eks. Natriumbisulfit), der bevæger sig ind i gelen foran proteinerne til opretholde et reducerende miljø. En yderligere fordel ved at bruge buffere med lavere pH -værdier er, at acrylamidgelen er mere stabil ved lavere pH -værdier, så gelerne kan opbevares i lange perioder før brug.

SDS gradientgelelektroforese af proteiner

Når spændingen påføres, vandrer anionerne (og negativt ladede prøve -molekyler) mod den positive elektrode (anode) i det nedre kammer, den ledende ion er Cl ^- (høj mobilitet og høj koncentration); glycinat er den bageste ion (lav mobilitet og lav koncentration). SDS-partikler overføres ikke frit ved grænsen mellem Cl ^- af gelen buffer, og Gly ^- katodens puffer. Friedrich Kohlrausch fandt ud af, at Ohms lov også gælder for opløste elektrolytter . På grund af spændingsfaldet mellem Cl ^- og glycinbufferne komprimeres (stables) proteiner til tynde mikrometerlag. Grænsen bevæger sig gennem en poregradient, og proteinstakken spredes gradvist på grund af en stigning i friktionsresistens af gelmatrixen. Stacking og unstacking sker kontinuerligt i gradientgelen for hvert protein i en anden position. For et komplet protein, der skal stables, skal polyacrylamid-gelkoncentrationen overstige 16% T. To-gel-systemet i "Laemmli" er en simpel gradientgel. PH-diskontinuiteten af bufferne er uden betydning for separationskvaliteten, og en "stablingsgel" med en anden pH-værdi er ikke nødvendig.

Visualisering

Den mest populære proteinplet er Coomassie Brilliant Blue . Det er et anionisk farvestof, som ikke-specifikt binder sig til proteiner. Proteiner i gelen fikseres med eddikesyre og farves samtidigt. Det overskydende farvestof, der er inkorporeret i gelen, kan fjernes ved farvning med den samme opløsning uden farvestoffet. Proteinerne detekteres som blå bånd på en klar baggrund.

Når der er brug for en mere følsom metode end farvning af Coomassie, bruges sølvfarvning normalt. Sølvfarvning er en følsom procedure til at detektere spormængder af proteiner i geler, men kan også visualisere nukleinsyre eller polysaccharider.

Visualiseringsmetoder uden brug af et farvestof som Coomassie og sølv er tilgængelige på markedet. For eksempel markedsfører Bio-Rad Laboratories ”pletfrie” geler til SDS-PAGE gelelektroforese. Alternativt kan reversible fluorescerende farvestoffer fra Azure Biosystems såsom AzureRed eller Azure TotalStain Q bruges.

På samme måde som ved nukleinsyregelelektroforese anvendes ofte sporingsfarvestof . Anioniske farvestoffer med en kendt elektroforetisk mobilitet er normalt inkluderet i prøvebufferen. Et meget almindeligt sporingsfarvestof er Bromophenolblåt . Dette farvestof er farvet ved alkali og neutral pH og er et lille negativt ladet molekyle, der bevæger sig mod anoden. Som et meget mobilt molekyle bevæger det sig foran de fleste proteiner.

Medicinske applikationer

Skematisk fremstilling af en proteinelektroforesegel.

Serumproteinelektroforese, der viser et paraprotein (top i gammazonen) hos en patient med myelomatose .

I medicin er proteinelektroforese en metode til at analysere proteiner hovedsageligt i blodserum . Før den udbredte anvendelse af gelelektroforese blev proteinelektroforese udført som elektroforese med frit flow (på papir) eller som immunoelektroforese.

Traditionelt overvejes to klasser af blodproteiner : serumalbumin og globulin . De er generelt lige store i forhold, men albumin som et molekyle er meget mindre og let, negativt ladet, hvilket fører til en ophobning af albumin på den elektroforetiske gel. Et lille bånd før albumin repræsenterer transthyretin (også kaldet prealbumin). Nogle former for medicin eller kropskemikalier kan forårsage deres eget bånd, men det er normalt lille. Unormale bånd (pigge) ses ved monoklonal gammopati af ubestemt betydning og myelomatose og er nyttige ved diagnosen af disse tilstande.

Globulinerne er klassificeret efter deres båndmønster (med deres vigtigste repræsentanter):

Den alfa (α) bånd består af to dele, 1 og 2:
- α ₁ - α ₁ antitrypsin , α ₁ -syre glycoprotein.
- α ₂ - haptoglobin , α ₂ -makroglobulin , a ₂ antiplasmin , ceruloplasmin .
Den beta (β) band - transferrin , LDL , komplement
Den gamma (γ) band - immunglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG og IgM). Paraproteiner (ved myelomatose) forekommer normalt i dette bånd.

Normal medicinsk procedure indebærer bestemmelse af talrige proteiner i plasma, herunder hormoner og enzymer, nogle af dem også bestemt ved elektroforese. Gelelektroforese er imidlertid hovedsageligt et forskningsværktøj, også når emnet er blodproteiner.

Languages

In other projects