Agarose - Agarose
.jpg)
Agarose er et polysaccharid , generelt udvundet af visse røde tang . Det er en lineær polymer, der består af den gentagende enhed af agarobiose, som er et disaccharid, der består af D -galactose og 3,6 -anhydro -L -galactopyranose. Agarose er en af de to hovedkomponenter i agar og renses fra agar ved at fjerne agars anden komponent, agaropectin .
Agarose bruges ofte i molekylærbiologi til adskillelse af store molekyler, især DNA , ved elektroforese . Plader af agarosegel (normalt 0,7 - 2%) til elektroforese fremstilles let ved at hælde den varme, flydende opløsning i en form. En lang række forskellige agaroser med varierende molekylvægte og egenskaber er kommercielt tilgængelige til dette formål. Agarose kan også formes til perler og anvendes i en række kromatografiske metoder til proteinrensning .
Struktur
Agarose er en lineær polymer med en molekylvægt på ca. 120.000, der består af skiftevis D - galactose og 3,6-anhydro- L- galactopyranose forbundet med α- (1 → 3) og β- (1 → 4) glycosidiske bindinger. 3,6 -anhydro -L -galactopyranose er en L -galactose med en anhydrobro mellem 3 og 6 positionerne, selvom nogle L -galactoseenheder i polymeren muligvis ikke indeholder broen. Nogle D -galactose- og L -galactose -enheder kan methyleres , og pyruvat og sulfat findes også i små mængder.
Hver agarosekæde indeholder ~ 800 molekyler galactose, og agarosepolymerkæderne danner spiralformede fibre, der aggregerer til supercoiled struktur med en radius på 20-30 nm . Fibrene er kvasi-stive og har en lang rækkevidde afhængigt af agarosekoncentrationen. Når de er størknet, danner fibrene et tredimensionelt net af kanaler med en diameter på fra 50 nm til> 200 nm afhængigt af den anvendte agarosekoncentration - højere koncentrationer giver lavere gennemsnitlige porediametre. 3D-strukturen holdes sammen med hydrogenbindinger og kan derfor afbrydes ved opvarmning til flydende tilstand.
Ejendomme
Agarose fås som et hvidt pulver, der opløses i næsten kogende vand og danner en gel, når det afkøles. Agarose udviser fænomenet termisk hysterese i sin væske-til-gel-overgang, dvs. det gelerer og smelter ved forskellige temperaturer. Gelerings- og smeltetemperaturerne varierer afhængigt af agarosetypen. Standardagaroser afledt af Gelidium har en geleringstemperatur på 34–38 ° C (93–100 ° F) og en smeltetemperatur på 90–95 ° C (194–203 ° F), mens de stammer fra Gracilaria på grund af dens højere methoxy -substituenter, har en geldannelsestemperatur på 40–52 ° C (104–126 ° F) og smeltetemperatur på 85–90 ° C (185–194 ° F). Smelte- og geleringstemperaturerne kan være afhængige af gelens koncentration, især ved lav gelkoncentration på mindre end 1%. Gelerings- og smeltetemperaturerne er derfor givet ved en bestemt agarosekoncentration.
Naturlig agarose indeholder uladede methylgrupper, og omfanget af methylering er direkte proportional med geleringstemperaturen. Syntetisk methylering har imidlertid den modsatte effekt, hvorved øget methylering sænker geleringstemperaturen. En række kemisk modificerede agaroser med forskellige smelte- og geleringstemperaturer er tilgængelige gennem kemiske modifikationer.
Agarosen i gelen danner et netværk, der indeholder porer, og størrelsen af porerne afhænger af koncentrationen af tilsat agarose. Ved henstand er agarosegelerne tilbøjelige til synerese (ekstrudering af vand gennem geloverfladen), men processen er langsom nok til ikke at forstyrre brugen af gelen.
Agarosegel kan have høj gelstyrke ved lav koncentration, hvilket gør den velegnet som et konvektionsmedium til gelelektroforese . Agarosegel så fortyndet som 0,15% kan danne plader til gelelektroforese. Agarosepolymeren indeholder ladede grupper, især pyruvat og sulfat . Disse negativt ladede grupper kan bremse bevægelsen af DNA -molekyler i en proces kaldet elektroendosmose (EEO), og lav EEO -agarose foretrækkes derfor generelt til anvendelse i agarosegelelektroforese af nukleinsyrer . Nul EEO agaroser er også tilgængelige, men disse kan være uønskede til nogle applikationer, da de kan fremstilles ved at tilføje positivt ladede grupper, der kan påvirke efterfølgende enzymreaktioner. Elektroendosmose er en årsag til, at agarose fortrinsvis anvendes frem for agar, da agaropectin i agar indeholder en betydelig mængde negativt ladede sulfat- og carboxylgrupper. Fjernelsen af agaropectin i agarose reducerer EEO væsentligt såvel som reducerer den uspecifikke adsorption af biomolekyler til gelmatrixen. For nogle anvendelser, såsom elektroforese af serumprotein, kan en høj EEO imidlertid være ønskelig, og agaropectin kan tilsættes i den anvendte gel.
Lav smeltende og gelerende temperatur agaroser
Smelte- og geleringstemperaturerne for agarose kan modificeres ved kemiske modifikationer, oftest ved hydroxyethylering, hvilket reducerer antallet af intrastrand hydrogenbindinger, hvilket resulterer i lavere smeltning og indstillingstemperaturer end standardagaroser. Den nøjagtige temperatur bestemmes af substitutionsgraden, og mange tilgængelige agaroser med lavt smeltepunkt (LMP) kan forblive flydende ved 30-35 ° C (86-95 ° F). Denne egenskab gør det muligt at udføre enzymatiske manipulationer direkte efter DNA -gelelektroforese ved at tilføje skiver smeltet gel indeholdende DNA -fragment af interesse til en reaktionsblanding. LMP -agarosen indeholder færre af de sulfater, der kan påvirke nogle enzymatiske reaktioner, og bruges derfor fortrinsvis til nogle anvendelser. Hydroxyethylering kan reducere porestørrelsen ved at reducere pakningstætheden af agarosebundterne, derfor kan LMP -gel også have en effekt på tiden og adskillelsen under elektroforese. Ultra-lavt smeltende eller gelerende temperatur agaroser må kun gelere ved 8-15 ° C (46-59 ° F).
Ansøgninger
Agarose er en foretrukken matrix til arbejde med proteiner og nukleinsyrer, da den har en bred vifte af fysisk, kemisk og termisk stabilitet, og dens lavere grad af kemisk kompleksitet gør den også mindre tilbøjelig til at interagere med biomolekyler . Agarose bruges mest som medium til elektroforetisk adskillelse i analytisk skala i agarosegelelektroforese . Geler fremstillet af renset agarose har en relativt stor porestørrelse, hvilket gør dem nyttige til adskillelse af store molekyler, såsom proteiner og proteinkomplekser> 200 kilodalton, samt DNA -fragmenter> 100 basepar. Agarose bruges også i vid udstrækning til en række andre anvendelser, for eksempel immunodiffusion og immunoelektroforese , da agarosefibrene fungerer som et anker for immunkomplekser .
Agarosegelelektroforese
Agarosegelelektroforese er rutinemetoden til opløsning af DNA i laboratoriet. Agarosegeler har lavere opløsningsevne for DNA end acrylamidgeler, men de har et større separationsinterval og bruges derfor normalt til DNA -fragmenter med længder på 50–20.000 bp ( basepar ), selvom opløsning på over 6 Mb er mulig med pulserende feltgelelektroforese (PFGE). Det kan også bruges til at adskille store proteinmolekyler, og det er den foretrukne matrix til gelelektroforese af partikler med effektive radier større end 5-10 nm.
Gelens porestørrelse påvirker størrelsen af det DNA, der kan sigtes. Jo lavere koncentration af gelen, jo større porestørrelse, og jo større DNA, der kan sigtes. Men geler med lav koncentration (0,1 - 0,2%) er skrøbelige og derfor svære at håndtere, og elektroforese af store DNA -molekyler kan tage flere dage. Opløsningsgrænsen for standard agarosegelelektroforese er omkring 750 kb. Denne grænse kan overvindes af PFGE, hvor alternerende ortogonale elektriske felter påføres gelen. DNA -fragmenterne omorienterer sig selv, når det anvendte felt skifter retning, men større molekyler af DNA tager længere tid at justere sig selv, når det elektriske felt ændres, mens det for de hurtigere er hurtigere, og DNA'et kan derfor fraktioneres efter størrelse.
Agarosegeler støbes i en form, og når de er sat, køres de normalt vandret nedsænket i en bufferopløsning. Tris-acetat-EDTA og Tris-Borat-EDTA- buffere bruges almindeligvis, men andre buffere, såsom Tris-phosphat, barbitursyre-natriumbarbiturat eller Tris- barbiturat- buffere kan anvendes i andre applikationer. DNA'et visualiseres normalt ved farvning med ethidiumbromid og derefter set under et UV -lys , men andre farvningsmetoder er tilgængelige, såsom SYBR Green , GelRed , methylenblåt og krystalviolet . Hvis de adskilte DNA -fragmenter er nødvendige for yderligere nedstrøms eksperiment, kan de skæres ud af gelen i skiver til yderligere manipulation.
Rensning af proteiner
Agarosegelmatrix bruges ofte til proteinrensning , f.eks. Ved søjlebaseret præparativ skala-adskillelse som ved gelfiltreringskromatografi , affinitetskromatografi og ionbytningskromatografi . Det bruges imidlertid ikke som en kontinuerlig gel, det er snarere formet til porøse perler eller harpikser med varierende finhed. Perlerne er meget porøse, så protein kan strømme frit gennem perlerne. Disse agarosebaserede perler er generelt bløde og let knuste, så de bør bruges under tyngdekraftsstrøm, lavhastighedscentrifugering eller lavtryksprocedurer. Harpikernes styrke kan forbedres ved øget tværbinding og kemisk hærdning af agaroseharpikser, men sådanne ændringer kan også resultere i en lavere bindingskapacitet for protein i nogle separationsprocedurer, såsom affinitetskromatografi .
Agarose er et nyttigt materiale til kromatografi, fordi det ikke absorberer biomolekyler i væsentligt omfang, har gode strømningsegenskaber og kan tåle ekstreme pH og ionstyrke samt høj koncentration af denaturanter, såsom 8M urinstof eller 6M guanidin -HCI . Eksempler på agarosebaseret matrix til gelfiltreringskromatografi er Sepharose og WorkBeads 40 SEC (tværbundet perle-agarose), Praesto og Superose (stærkt tværbundet perle-agaroser) og Superdex ( dextran kovalent bundet til agarose).
Til affinitetskromatografi er beaded agarose den mest almindeligt anvendte matrixharpiks til fastgørelse af ligander, der binder protein. Liganderne bindes kovalent gennem en afstandsstykker til aktiverede hydroxylgrupper af agarosepolymer. Proteiner af interesse kan derefter selektivt bindes til liganderne for at adskille dem fra andre proteiner, hvorefter det kan elueres. De anvendte agarosekugler har typisk en densitet på 4% og 6% med en høj bindingskapacitet for protein.
Solide kulturmedier
Agaroseplade kan undertiden bruges i stedet for agar til dyrkning af organismer, da agar kan indeholde urenheder, der kan påvirke væksten af organismen eller nogle nedstrøms procedurer, såsom polymerasekædereaktion (PCR). Agarose er også hårdere end agar og kan derfor være at foretrække, hvor større gelstyrke er nødvendig, og dens lavere geldannelsestemperatur kan forhindre forårsage termisk stød for organismen, når cellerne suspenderes i væske før gelering. Det kan anvendes til dyrkning af strenge autotrofe bakterier, planter protoplast , Caenorhabditis elegans , andre organismer og forskellige cellelinier.
3D cellekultur
Agarose anvendes ofte som underlag for et tredimensionalt kultur af humane og animalske celler . Fordi agarose danner en ikke-cytotoksisk hydrogel , kan den bruges til at reproducere det naturlige miljø af celler i menneskekroppen, den ekstracellulære matrix . Agarose danner imidlertid en stiv inert hydrogel , der ikke bærer nogen biologisk information, og derfor kan mennesker og dyreceller ikke klæbe til polysaccharidet . På grund af disse Fejldetaljer egenskaber, agarose hydrogelmaterialer efterligner det naturlige miljø i brusk har celler og vist sig at understøtte differentiering af chondrocytter i brusk . For at ændre de mekaniske egenskaber ved agarose for at reproducere det naturlige miljø i andre humane celler, kan agarose modificeres kemisk gennem den præcise oxidation af D- galactosens primære alkohol til carboxylsyre . Denne kemiske modifikation tilvejebringer en ny klasse materialer kaldet carboxyleret agarose. Gennem kontrollen over antallet af carboxyleret D-galactose på polysaccharid- rygraden kan de mekaniske egenskaber af den resulterende hydrogel kontrolleres præcist. Disse carboxylerede agarose -hydrogeler kan derefter bindes kovalent til peptider for at danne hydrogel, som celler kan klæbe til. Disse carboxylerede agarose -hydrogeler har vist sig at lede organisationen af humane endotelceller i polariserede lumen. Blanding af fuldt carboxyleret agarose med naturlig agarose kan bruges til at lave hydrogeler, der spænder over en lang række mekaniske egenskaber.
Motilitet assays
Agarose bruges undertiden i stedet for agar til at måle mikroorganismes motilitet og mobilitet. Motile arter vil være i stand til at migrere, omend langsomt, gennem hele den porøse gel, og infiltrationshastigheder kan derefter visualiseres. Gelens porøsitet er direkte relateret til koncentrationen af agar eller agarose i mediet, så forskellige koncentrationsgeler kan bruges til at vurdere en celles svømmende , sværmende , glidende og rykende motilitet. Under-agarosecellevandringsassay kan anvendes til måling af kemotaksi og kemokinesis. Et lag agarosegel placeres mellem en cellepopulation og et kemoattraktivt middel . Efterhånden som en koncentrationsgradient udvikler sig fra diffusionen af kemoattraktanten ind i gelen, kan forskellige cellepopulationer, der kræver forskellige stimuleringsniveauer for at migrere, derefter visualiseres over tid ved hjælp af mikrofotografi, når de tunnel opad gennem gelen mod tyngdekraften langs gradienten.