DNA -vaccine - DNA vaccine

Fremstilling af en DNA -vaccine.

En DNA-vaccine er en type vaccine , som transficerer et specifikt antigen -kodende DNA -sekvens i cellerne i en organisme som en mekanisme til at inducere et immunrespons.

DNA -vacciner virker ved at injicere genetisk manipuleret plasmid indeholdende DNA -sekvensen, der koder for det eller de antigener, som immunrespons søges mod, så cellerne producerer antigenet direkte og forårsager dermed en beskyttende immunologisk reaktion . DNA -vacciner har teoretiske fordele i forhold til konventionelle vacciner, herunder "evnen til at fremkalde en bredere vifte af typer af immunrespons". Flere DNA -vacciner er blevet testet til veterinær brug. I nogle tilfælde er der opnået beskyttelse mod sygdom hos dyr, i andre ikke. Forskning i gang om tilgangen til virale, bakterielle og parasitære sygdomme hos mennesker såvel som til kræft. I august 2021 gav indiske myndigheder nødgodkendelse til ZyCoV-D . Det er udviklet af Cadila Healthcare og er den første DNA -vaccine, der er godkendt til mennesker.

Historie

Konventionelle vacciner indeholder enten specifikke antigener fra et patogen eller svækkede vira, der stimulerer et immunrespons i den vaccinerede organisme. DNA -vacciner er medlemmer af de genetiske vacciner , fordi de indeholder en genetisk information (DNA eller RNA), der koder for cellulær produktion ( proteinbiosyntese ) af et antigen . DNA -vacciner indeholder DNA, der koder for specifikke antigener fra et patogen. DNA'et injiceres i kroppen og optages af celler, hvis normale metaboliske processer syntetiserer proteiner baseret på den genetiske kode i plasmidet, de har optaget. Fordi disse proteiner indeholder områder af aminosyresekvenser, der er karakteristiske for bakterier eller vira, genkendes de som fremmede, og når de behandles af værtscellerne og vises på deres overflade, advares immunsystemet, som derefter udløser immunrespons. Alternativt kan DNA'et være indkapslet i protein for at lette celletilførsel. Hvis dette capsidprotein er inkluderet i DNA'et, kan den resulterende vaccine kombinere styrken af ​​en levende vaccine uden reverseringsrisici.

I 1983 udformede Enzo Paoletti og Dennis Panicali ved New York Department of Health en strategi for at producere rekombinante DNA -vacciner ved hjælp af genteknologi til at omdanne almindelig koppevaccine til vacciner, der muligvis kan forhindre andre sygdomme. De ændrede ko -virusviruss DNA ved at indsætte et gen fra andre vira (nemlig Herpes simplex -virus , hepatitis B og influenza ). I 1993 demonstrerede Jeffrey Ulmer og kolleger ved Merck Research Laboratories , at direkte injektion af mus med plasmid-DNA, der koder for et influenzeantigen, beskytter dyrene mod efterfølgende eksperimentel infektion med influenzavirus. I 2016 begyndte en DNA -vaccine til Zika -virus at teste hos mennesker på National Institutes of Health . Undersøgelsen var planlagt til at involvere op til 120 forsøgspersoner i alderen 18 til 35 år. Separat begyndte Inovio Pharmaceuticals og GeneOne Life Science test af en anden DNA -vaccine mod Zika i Miami. NIH -vaccinen injiceres i overarmen under højt tryk. Fremstilling af vaccinerne i volumen forblev uløst i august 2016. Kliniske forsøg med DNA -vacciner til forebyggelse af HIV er i gang.

I august 2021 gav indiske myndigheder nødgodkendelse til ZyCoV-D. Det er udviklet af Cadila Healthcare og er den første DNA-vaccine mod COVID-19 .

Ansøgninger

I 2021 er der ikke blevet godkendt nogen DNA -vacciner til mennesker i USA. Få eksperimentelle forsøg har fremkaldt et svar, der er stærkt nok til at beskytte mod sygdom, og teknikkens nytteværdi mangler at blive bevist hos mennesker. En veterinær DNA -vaccine til beskyttelse af heste mod West Nile -virus er blevet godkendt. DNA -immunisering undersøges også som et middel til at udvikle antivenomsera. DNA -immunisering kan bruges som en teknologiplatform til monoklonal antistofinduktion.

Fordele

• Ingen risiko for infektion
• Antigenpræsentation af både MHC klasse I og klasse II molekyler
• Polariser T-cellers respons mod type 1 eller type 2
• Immunrespons fokuserede på antigenet af interesse
• Nem udvikling og produktion
• Stabilitet til opbevaring og forsendelse
• Omkostningseffektivitet
• Fjerner behovet for peptidsyntese, ekspression og oprensning af rekombinante proteiner og anvendelse af toksiske adjuvanser
• Langvarig persistens af immunogen
• In vivo- ekspression sikrer, at protein mere ligner normal eukaryot struktur med tilhørende post-translationelle ændringer

Ulemper

• Begrænset til proteinimmunogener (ikke nyttig til ikke-proteinbaserede antigener såsom bakterielle polysaccharider)
• Potentiale for atypisk behandling af bakterie- og parasitproteiner
• Potentiale ved brug af næsesprayadministration af plasmid-DNA-nanopartikler til transfektion af ikke-målceller, såsom hjerneceller
• Krydsforurening ved fremstilling af forskellige typer levende vacciner på samme facilitet

Plasmidvektorer

Vektor design

DNA-vacciner fremkalder det bedste immunrespons, når der anvendes vektorer med høj ekspression. Disse er plasmider , der normalt består af en stærk viral promoter til at drive in vivo transkription og translation af genet (eller komplementær DNA ) af interesse. Intron A kan undertiden inkluderes for at forbedre mRNA -stabilitet og dermed øge proteinekspression. Plasmider inkluderer også et stærkt polyadenylerings- /transkriptionelt termineringssignal , såsom bovint væksthormon eller kanin- beta-globulin- polyadenyleringssekvenser. Polycistroniske vektorer (med flere gener af interesse) er undertiden konstrueret til at udtrykke mere end et immunogen eller til at udtrykke et immunogen og et immunstimulerende protein.

Fordi plasmidet - der bærer relativt lille genetisk kode op til ca. 200 K bp  - er det "vehikel", hvorfra immunogenet udtrykkes, er det vigtigt at optimere vektordesign til maksimal proteinekspression. En måde at forbedre proteinekspression på er ved at optimere kodonbrugen af patogene mRNA'er til eukaryote celler. Patogener har ofte et andet AT-indhold end målarten, så ændring af immunogenets gensekvens for at afspejle de kodoner, der er mere almindeligt anvendt i målarten, kan forbedre dets ekspression.

En anden overvejelse er valg af promotor . Den SV40 -promotoren blev konventionelt anvendes indtil forskning viste, at vektorer drevet af Rous Sarcoma Virus (RSV) promoteren havde meget højere ekspressionshastigheder. For nylig er ekspression og immunogenicitet blevet yderligere forøget i modelsystemer ved brug af cytomegalovirus (CMV) umiddelbar tidlig promotor og et retroviralt cis-virkende transkriptionselement . Yderligere modifikationer til forbedring af ekspressionshastigheder omfatter indsættelse af enhancersekvenser, syntetiske introner , adenovirus tripartite leader (TPL) sekvenser og modifikationer af polyadenylerings- og transkriptionelle terminationssekvenser. Et eksempel på DNA -vaccineplasmid er pVAC, som anvender SV40 -promotor .

Strukturelle ustabilitetsfænomener er af særlig bekymring for plasmidfremstilling, DNA -vaccination og genterapi. Tilbehørsområder, der vedrører plasmidryggen, kan deltage i en lang række strukturelle ustabilitetsfænomener. Kendte katalysatorer af genetisk ustabilitet omfatter direkte, inverterede og tandem-gentagelser, som er iøjnefaldende i mange kommercielt tilgængelige klonings- og ekspressionsvektorer. Derfor ville reduktion eller fuldstændig eliminering af fremmede ikke -kodende rygradssekvenser på en tydelig måde reducere tilbøjeligheden til, at sådanne hændelser finder sted og følgelig det samlede plasmids rekombinogene potentiale.

Mekanisme af plasmider

Når plasmidet indsættes i den transficerede cellekerne, koder det for en peptidstreng af et fremmed antigen. På overfladen viser cellen det fremmede antigen med både histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og klasse II molekyler. Den antigenpræsenterende celle rejser derefter til lymfeknuderne og præsenterer antigenpeptidet og det costimulatoriske molekyle, der signalerer til T-celle, hvilket initierer immunresponset.

Design af vaccinindsats

Immunogener kan målrettes mod forskellige cellulære rum for at forbedre antistof eller cytotoksiske T-cellers respons. Udskilte eller plasmamembranbundne antigener er mere effektive til at inducere antistofrespons end cytosoliske antigener, mens cytotoksiske T -celle -responser kan forbedres ved at målrette antigener mod cytoplasmatisk nedbrydning og efterfølgende indtræden i den store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I -vej. Dette opnås sædvanligvis ved tilføjelse af N-terminale ubiquitinsignaler .

Den konformation af proteinet kan også påvirke antistofresponser. "Ordnede" strukturer (såsom virale partikler) er mere effektive end uordnede strukturer. Strenge af minigener (eller MHC klasse I epitoper ) fra forskellige patogener øger cytotoksiske T-cellers respons på nogle patogener, især hvis en TH-epitop også er inkluderet.

Levering

DNA -vaccine og genterapiteknikker ligner hinanden.

DNA -vacciner er blevet indført i dyrevæv ved flere metoder. I 1999 var de to mest populære fremgangsmåder injektion af DNA i saltvand : ved hjælp af en standard injektionsnål eller ved hjælp af en genpistollevering . Flere andre teknikker er blevet dokumenteret i de mellemliggende år.

Saltvandsindsprøjtning

Injektion i saltvand udføres normalt intramuskulært (IM) i skeletmuskulatur eller intradermalt (ID), hvilket leverer DNA til ekstracellulære rum. Dette kan bistås enten 1) ved elektroporation ; 2) ved midlertidigt at beskadige muskelfibre med myotoksiner, såsom bupivacain ; eller 3) ved anvendelse af hypertoniske opløsninger af saltvand eller saccharose . Immunresponser på denne metode kan påvirkes af faktorer, herunder nåletype, nålejustering, injektionshastighed, injektionsvolumen, muskeltype og alder, køn og fysiologisk tilstand hos modtageren.

Genpistol

Genkanon levering ballistisk accelererer plasmid-DNA (pDNA), som er absorberet på guld eller wolfram -mikropartikler i målcellerne, med komprimeret helium som en accelerator.

Slimhindeoverflade levering

Alternativer inkluderet aerosol instillation af nøgent DNA på mucosale overflader, såsom det nasale og lunge slimhinde , og topisk administration af pDNA til øjet og vaginale slimhinde. Slimhindeoverfladeoverførsel er også opnået ved anvendelse af kationiske liposom -DNA -præparater, bionedbrydelige mikrosfærer, svækkede Salmonalla- , Shigella- eller Listeria -vektorer til oral administration til tarmslimhinden og rekombinante adenovirusvektorer.

Polymer køretøj

En hybridbærer sammensat af bakterieceller og syntetiske polymerer er blevet anvendt til levering af DNA -vacciner. En E. coli indre kerne og poly (beta-aminoester) ydre pels fungerer synergistisk for at øge effektiviteten ved at adressere barrierer forbundet med antigenpræsenterende cellegenlevering, som omfatter cellulær optagelse og internalisering, fagosomal flugt og intracellulær lastkoncentration. Testet i mus viste det sig, at hybridvektoren inducerede immunrespons.

ELI -immunisering

En anden tilgang til DNA -vaccination er ekspressionsbiblioteksimmunisering (ELI). Ved hjælp af denne teknik kan potentielt alle gener fra et patogen leveres på én gang, hvilket kan være nyttigt for patogener, der er svære at dæmpe eller dyrke. ELI kan bruges til at identificere, hvilke gener der fremkalder en beskyttende reaktion. Dette er blevet testet med Mycoplasma pulmonis , et murint lungepatogen med et relativt lille genom . Selv delvise ekspressionsbiblioteker kan fremkalde beskyttelse mod efterfølgende udfordringer.

Nyttig tabel sammenligning

Dosering

Leveringsmetoden bestemmer den dosis, der kræves for at øge et effektivt immunrespons. Saltvandsindsprøjtninger kræver variable mængder DNA fra 10 ug til 1 mg, hvorimod genpistolleverancer kræver 100 til 1000 gange mindre. Generelt kræves 0,2 μg - 20 μg, selvom mængder helt ned til 16 ng er blevet rapporteret. Disse mængder varierer efter art. Mus kræver f.eks. Cirka 10 gange mindre DNA end primater . Saltvandsindsprøjtninger kræver mere DNA, fordi DNA'et leveres til målvævets ekstracellulære rum (normalt muskel), hvor det skal overvinde fysiske barrierer (såsom basallamina og store mængder bindevæv ), før det tages op af celler, mens genpistolleverancer driver/tvinger DNA direkte ind i cellerne, hvilket resulterer i mindre "spild".

Immunrespons

Hjælper T -cellers reaktioner

Antigenpræsentation stimulerer T -celler til enten at blive "cytotoksiske" CD8+ celler eller "hjælper" CD4+ celler. Cytotoksiske celler angriber direkte andre celler, der bærer visse fremmede eller unormale molekyler på deres overflader. Hjælper T -celler eller Th -celler koordinerer immunrespons ved at kommunikere med andre celler. I de fleste tilfælde genkender T -celler kun et antigen, hvis det bæres på overfladen af ​​en celle af et af kroppens egne MHC- eller større histokompatibilitetskompleks -molekyler.

DNA -immunisering kan øge flere _TH -responser, herunder lymfoproliferation og generering af en række forskellige cytokinprofiler . En stor fordel ved DNA-vacciner er den lethed, hvormed de kan manipuleres med at forspænge typen af ​​T-cellehjælp mod et TH1- eller TH2-respons. Hver type har særprægede mønstre for lymfokin- og kemokinekspression, specifikke typer immunglobuliner , mønstre for lymfocythandel og typer af medfødte immunresponser .

Andre former for T-cellehjælp

Den type T-cellehjælp, der rejses, påvirkes af leveringsmetoden og den type immunogen, der udtrykkes, samt målretning af forskellige lymfoide rum. Generelt har saltvandsnålinjektioner (enten IM eller ID) tendens til at inducere TH1 -responser, mens genpistollevering øger TH2 -responser. Dette gælder for intracellulære og plasmamembranbundne antigener, men ikke for udskillede antigener, som synes at generere TH2-responser, uanset leveringsmetode.

Generelt er den type T-cellehjælp, der rejses, stabil over tid og ændres ikke, når den udfordres eller efter efterfølgende immuniseringer, der normalt ville have øget den modsatte type respons i en naiv prøve. Mor et al. . (1995) immuniseret og boostet mus med pDNA koder for circumsporozoitproteinet af musen malaria -parasitten Plasmodium yoelii (PyCSP) og fandt, at den oprindelige TH2 respons ændret, efter boosting, til en TH1-respons.

Grundlag for forskellige former for T-cellehjælp

Hvordan disse forskellige metoder fungerer, formerne for antigen udtrykt og de forskellige profiler af T-cellehjælp forstås ikke. Man mente, at de relativt store mængder DNA, der blev brugt ved IM -injektion, var ansvarlige for induktionen af ​​TH1 -responser. Imidlertid viser beviser ingen dosisrelaterede forskelle i TH-type. Den type T-cellehjælp, der rejses, bestemmes af den differentierede tilstand af antigenpræsenterende celler . Dendritiske celler kan differentiere sig til at udskille IL-12 (som understøtter TH1-celleudvikling) eller IL-4 (som understøtter TH2-responser). pDNA injiceret med nål endocytoseres i den dendritiske celle, som derefter stimuleres til at differentiere for TH1 -cytokinproduktion , mens genpistolen bombarderer DNA'et direkte ind i cellen og dermed omgår TH1 -stimulering.

Praktisk anvendelse af polariseret T-cellehjælp

Polarisering i T-cellehjælp er nyttig til at påvirke allergiske reaktioner og autoimmune sygdomme . Ved autoimmune sygdomme er målet at flytte det selvdestruktive TH1-respons (med dets tilhørende cytotoksiske T-celleaktivitet) til et ikke-destruktivt TH2-svar. Dette er med succes blevet anvendt i primisease -priming for den ønskede type respons i prækliniske modeller og er noget vellykket med at flytte responset for en etableret sygdom.

Cytotoksiske T-cellersvar

En af fordelene ved DNA -vacciner er, at de er i stand til at inducere cytotoksiske T -lymfocytter (CTL) uden den iboende risiko forbundet med levende vacciner. CTL -responser kan rejses mod immunodominante og immunoressive CTL -epitoper såvel som subdominante CTL -epitoper på en måde, der ser ud til at efterligne naturlig infektion . Dette kan vise sig at være et nyttigt værktøj til vurdering af CTL -epitoper og deres rolle i at levere immunitet.

Cytotoksiske T-celler genkender små peptider (8-10 aminosyrer ) kompleksbundet til MHC klasse I- molekyler. Disse peptider er afledt af endogene cytosoliske proteiner, der nedbrydes og afleveres til det begyndende MHC klasse I -molekyle inden for det endoplasmatiske retikulum (ER). Målretning genprodukter direkte til ER (ved tilsætning af en aminoterminal insertion sekvens ) bør således øge CTL-responser. Dette blev vellykket demonstreret ved hjælp af rekombinante vacciniavira, der udtrykker influenzaproteiner , men princippet bør også være gældende for DNA -vacciner. Målretning af antigener for intracellulær nedbrydning (og dermed indtræden i MHC klasse I -vejen) ved tilsætning af ubiquitinsignalsekvenser eller mutation af andre signalsekvenser viste sig at være effektiv til at øge CTL -responser.

CTL-responser kan forstærkes ved co-inokulation med co-stimulerende molekyler, såsom B7-1 eller B7-2, til DNA-vacciner mod influenza-nukleoprotein eller GM-CSF til DNA-vacciner mod murine malaria-modellen P. yoelii . Co-inokulation med plasmider, der koder for co-stimulerende molekyler IL-12 og TCA3, viste sig at øge CTL-aktivitet mod HIV-1 og influenza-nukleoproteinantigener.

Humoral (antistof) respons

Skematisk diagram af et antistof og antigener

Antistofresponser fremkaldt af DNA -vaccinationer påvirkes af flere variabler, herunder antigentype; antigenplacering (dvs. intracellulær vs. udskilt); antal, hyppighed og immuniseringsdosis; sted og metode til antigenafgivelse.

Kinetik af antistofrespons

Humorale reaktioner efter en enkelt DNA-injektion kan have meget længere levetid end efter en enkelt injektion med et rekombinant protein. Antistofresponser mod hepatitis B -virus (HBV) -hylsterprotein (HBsAg) er blevet opretholdt i op til 74 uger uden boost, mens livslang opretholdelse af beskyttende respons på influenza hæmagglutinin blev påvist i mus efter genpistollevering. Antistofudskillende celler migrerer til knoglemarven og milten til langsigtet antistofproduktion og lokaliserer der generelt efter et år.

Sammenligninger af antistofresponser genereret ved naturlig (viral) infektion, immunisering med rekombinant protein og immunisering med pDNA er opsummeret i tabel 4. DNA-hævede antistofresponser stiger meget langsommere end når der sker naturlig infektion eller rekombinant proteinimmunisering. Så mange som 12 uger kan være påkrævet for at nå toptitre hos mus, selvom boosting kan reducere intervallet. Dette svar skyldes sandsynligvis de lave niveauer af antigen udtrykt over flere uger, hvilket understøtter både primære og sekundære faser af antistofrespons. DNA -vaccine, der udtrykker HBV -lille og mellemhylsterprotein, blev injiceret i voksne med kronisk hepatitis. Vaccinen resulterede i specifik interferon gamma -celleproduktion. Også specifikke T-celler til middelhylsterproteinantigener blev udviklet. Patienternes immunrespons var ikke robust nok til at kontrollere HBV -infektion

Derudover er titre af specifikke antistoffer frembragt ved DNA -vaccination lavere end dem, der opnås efter vaccination med et rekombinant protein. Imidlertid viser DNA-immuniseringsinducerede antistoffer større affinitet til native epitoper end rekombinante proteininducerede antistoffer. Med andre ord inducerer DNA -immunisering en kvalitativt bedre respons. Antistoffer kan induceres efter en vaccination med DNA, hvorimod rekombinante proteinvaccinationer generelt kræver et boost. DNA -immunisering kan bruges til at skæve TH -profilen for immunresponset og dermed antistofisotypen, hvilket ikke er muligt med hverken naturlig infektion eller rekombinant proteinimmunisering. Antistofreaktioner genereret af DNA er nyttige som et forberedende værktøj. F.eks. Kan polyklonale og monoklonale antistoffer genereres til brug som reagenser.

Mekanistisk grundlag for DNA-forhøjede immunresponser

DNA -optagelsesmekanisme

Da DNA-optagelse og efterfølgende ekspression først blev demonstreret in vivo i muskelceller , blev disse celler antaget at være unikke på grund af deres omfattende netværk af T-tubuli. Ved hjælp af elektronmikroskopi blev det foreslået, at DNA-optagelse blev lettere af caveolae (eller, ikke-clathrinovertrukne gruber). Efterfølgende forskning viste imidlertid, at andre celler (såsom keratinocytter , fibroblaster og epiteliale Langerhans -celler ) også kunne internalisere DNA. Mekanismen for DNA -optagelse kendes ikke.

To teorier dominerer - at in vivo optagelse af DNA sker ikke -specifikt, i en metode, der ligner phago - eller pinocytose , eller gennem specifikke receptorer. Disse kan omfatte en 30 kDa overflade -receptor , eller makrofag scavenger receptorer. 30kDa overfladereceptoren binder specifikt til 4500 bp DNA-fragmenter (som derefter internaliseres) og findes på professionelle APC'er og T-celler. Makrofag -scavenger -receptorer binder til en række forskellige makromolekyler, herunder poly -ribonukleotider og er således kandidater til DNA -optagelse. Receptormedieret DNA-optagelse kunne lettes ved tilstedeværelsen af polyguanylatsekvenser . Genpistolleveringssystemer, kationisk liposomemballage og andre leveringsmetoder omgår denne indtastningsmetode, men forståelse af den kan være nyttig til at reducere omkostninger (f.eks. Ved at reducere kravet til cytofektiner), hvilket kan være vigtigt i husdyrhold.

Antigenpræsentation af knoglemarvsafledte celler

En dendritisk celle.

Undersøgelser med kimære mus har vist, at antigen præsenteres af celler fra knoglemarv, som omfatter dendritiske celler, makrofager og specialiserede B-celler kaldet professionelle antigenpræsenterende celler (APC). Efter injektion af genpistol til huden migrerer transficerede Langerhans -celler til den drænende lymfeknude for at præsentere antigener. Efter IM- og ID -injektioner findes dendritiske celler antigen i den drænende lymfeknude og transficerede makrofager er fundet i det perifere blod.

Udover direkte transfektion af dendritiske celler eller makrofager forekommer krydsprimning efter leveringer af IM, ID og genpistol. Krydsprimning opstår, når en knoglemarvsafledt celle præsenterer peptider fra proteiner syntetiseret i en anden celle i forbindelse med MHC-klasse 1. Dette kan udløse cytotoksiske T-celleresponser og synes at være vigtig for et fuldstændigt primært immunrespons.

Mål webstedets rolle

IM- og ID -DNA -levering initierer immunrespons forskelligt. I huden tager keratinocytter, fibroblaster og Langerhans -celler op og udtrykker antigener og er ansvarlige for at inducere et primært antistofrespons. Transfekterede Langerhans-celler vandrer ud af huden (inden for 12 timer) til den drænende lymfeknude, hvor de primære sekundære B- og T-celle-responser. I skeletmuskulatur transfekteres striberede muskelceller oftest, men synes at være uvæsentlige i immunrespons. I stedet "vasker" IM inokuleret DNA i den drænende lymfeknude inden for få minutter, hvor distale dendritiske celler transficeres og derefter initierer et immunrespons. Transfekterede myocytter ser ud til at fungere som et "reservoir" af antigen til handel med professionelle APC'er.

Vedligeholdelse af immunrespons

DNA-vaccination genererer en effektiv immunhukommelse via visning af antigen-antistofkomplekser på follikulære dendritiske celler (FDC), som er kraftige B-celle-stimulatorer. T-celler kan stimuleres af lignende, germinal center dendritiske celler. FDC er i stand til at generere en immunhukommelse, fordi produktion af antistoffer "overlapper" langsigtet ekspression af antigen, så antigen-antistof-immunkomplekser kan dannes og vises af FDC.

Interferoner

Både hjælper og cytotoksiske T-celler kan kontrollere virusinfektioner ved at udskille interferoner. Cytotoksiske T -celler dræber normalt viralt inficerede celler. De kan imidlertid også stimuleres til at udskille antivirale cytokiner såsom IFN-γ og TNF-α , som ikke dræber cellen, men begrænser virusinfektion ved at nedregulere ekspressionen af ​​virale komponenter. DNA-vaccinationer kan bruges til at bremse virusinfektioner ved ikke-destruktiv IFN-medieret kontrol. Dette blev demonstreret for hepatitis B. IFN-γ er kritisk vigtigt til bekæmpelse af malariainfektioner og er en overvejelse for anti-malaria DNA-vacciner.

Immunresponsmodulation

Cytokin modulering

En effektiv vaccine skal fremkalde et passende immunrespons for et givet patogen. DNA-vacciner kan polarisere T-cellehjælp mod TH1- eller TH2-profiler og generere CTL og/eller antistof efter behov. Dette kan opnås ved ændringer af udtrykt form af antigen (dvs. intracellulært vs. udskilt), fremgangsmåden og leveringsvej eller dosis. Det kan også opnås ved samtidig administration af plasmid-DNA, der koder for immunregulerende molekyler, dvs. cytokiner, lymfokiner eller co-stimulerende molekyler. Disse "genetiske adjuvanser " kan administreres som:

• blanding af 2 plasmider, den ene, der koder for immunogenet og den anden, der koder for cytokinet
• enkelt bi- eller polycistronisk vektor, adskilt af afstandsstykker
• plasmid-kodet kimære eller fusionsprotein

Generelt øger co-administration af proinflammatoriske midler (såsom forskellige interleukiner , tumornekrosefaktor og GM-CSF) plus TH2-inducerende cytokiner antistofresponser, hvorimod pro-inflammatoriske midler og TH1-inducerende cytokiner reducerer humorale reaktioner og øger cytotoksiske reaktioner (vigtigere i virusbeskyttelse). Co-stimulerende molekyler såsom B7-1 , B7-2 og CD40L bruges undertiden.

Dette koncept blev anvendt i topisk administration af pDNA, der koder for IL-10 . Plasmid, der koder for B7-1 (en ligand på APC'er) forbedrede med succes immunresponset i tumormodeller. Blanding af plasmider, der koder for GM-CSF og circumsporozoit-proteinet fra P. yoelii (PyCSP), forbedrede beskyttelsen mod efterfølgende udfordring (hvorimod plasmid-kodet PyCSP alene ikke gjorde det). Det blev foreslået, at GM-CSF fik dendritiske celler til at præsentere antigen mere effektivt og øge IL-2-produktionen og TH-celleaktivering og dermed øge det øgede immunrespons. Dette kan forstærkes yderligere ved først at starte med en pPyCSP- og pGM-CSF-blanding efterfulgt af boosting med et rekombinant poxvirus, der udtrykker PyCSP. Co-injektion af plasmider, der koder for GM-CSF (eller IFN-γ eller IL-2) og et fusionsprotein af P. chabaudi merozoite overfladeprotein 1 (C-terminus) -hepatitis B-virusoverfladeprotein (PcMSP1-HBs) afskaffet beskyttelsen mod udfordring sammenlignet med beskyttelse opnået ved levering af pPcMSP1-HB'er alene.

Fordelene ved genetiske adjuvanser er deres lave omkostninger og enkel administration samt undgåelse af ustabile rekombinante cytokiner og potentielt toksiske, "konventionelle" adjuvanser (såsom alun , calciumphosphat , monophosphoryl lipid A, kolera toksin, kationiske og mannan-coatede liposomer , QS21 , carboxymethylcellulose og ubenimix ). Den potentielle toksicitet ved forlænget cytokinekspression er imidlertid ikke fastslået. I mange kommercielt vigtige dyrearter er cytokingener ikke blevet identificeret og isoleret. Desuden modulerer forskellige plasmidkodede cytokiner immunsystemet forskelligt afhængigt af leveringstiden. For eksempel leveres nogle cytokinplasmid-DNA'er bedst efter immunogen pDNA, fordi præ- eller co-levering kan reducere specifikke responser og øge ikke-specifikke responser.

Immunstimulerende CpG -motiver

Plasmid -DNA synes selv at have en adjuvansvirkning på immunsystemet. Bakterielt afledt DNA kan udløse medfødte immunforsvarsmekanismer, aktivering af dendritiske celler og produktion af TH1 -cytokiner. Dette skyldes genkendelse af visse CpG -dinucleotidsekvenser, der er immunstimulerende. CpG-stimulerende (CpG-S) sekvenser forekommer tyve gange oftere i bakterielt afledt DNA end i eukaryoter. Det skyldes, at eukaryoter udviser "CpG -undertrykkelse" - dvs. CpG -dinukleotidpar forekommer meget sjældnere end forventet. Derudover hypomethyleres CpG-S-sekvenser. Dette forekommer ofte i bakterielt DNA, mens CpG -motiver, der forekommer i eukaryoter, methyleres ved cytosinnukleotidet. I modsætning hertil er nukleotidsekvenser, der hæmmer aktiveringen af ​​et immunrespons (betegnet CpG-neutralisering eller CpG-N), overrepræsenteret i eukaryote genomer. Den optimale immunstimulerende sekvens er et umetyleret CpG -dinukleotid flankeret af to 5' -puriner og to 3' -pyrimidiner . Derudover flankerende regioner uden denne immunstimulerende hexamer skal være guanin -rige at sikre binding og optagelse i målceller.

Det medfødte system arbejder sammen med det adaptive immunsystem for at montere en reaktion mod det DNA -kodede protein. CpG-S-sekvenser fremkalder polyklonale B-celleaktivering og opregulering af cytokinekspression og sekretion. Stimulerede makrofager udskiller IL-12, IL-18 , TNF-α, IFN-α, IFN-β og IFN-γ, mens stimulerede B-celler udskiller IL-6 og noget IL-12.

Manipulation af CpG-S- og CpG-N-sekvenser i plasmid-rygraden i DNA-vacciner kan sikre succesen af ​​immunresponset mod det kodede antigen og drive immunresponset mod en TH1-fænotype. Dette er nyttigt, hvis et patogen kræver et TH -svar for beskyttelse. CpG-S-sekvenser er også blevet brugt som eksterne adjuvanser til både DNA- og rekombinant proteinvaccination med variable succesrater. Andre organismer med hypomethylerede CpG-motiver har demonstreret stimulering af polyklonale B-celleudvidelse. Mekanismen bag dette kan være mere kompliceret end simpel methylering - hypomethyleret murint DNA har ikke vist sig at være et immunrespons.

De fleste beviser for immunstimulerende CpG -sekvenser stammer fra murine undersøgelser. Ekstrapolering af disse data til andre arter kræver forsigtighed - enkelte arter kan kræve forskellige flankerende sekvenser, da bindingsspecificiteter for scavenger -receptorer varierer på tværs af arter. Derudover kan arter som drøvtyggere være ufølsomme over for immunstimulerende sekvenser på grund af deres store gastrointestinale belastning.

Alternative boosts

DNA-primede immunresponser kan forstærkes ved administration af rekombinant protein eller rekombinant poxvirus. "Prime-boost" -strategier med rekombinant protein har med succes øget både neutraliserende antistoftiter og antistofaviditet og persistens for svage immunogener, såsom HIV-1-kappeprotein. Rekombinante virusforøgelser har vist sig at være meget effektive til at øge DNA-primede CTL-responser. Priming med DNA fokuserer immunresponsen på det nødvendige immunogen, mens boosting med det rekombinante virus giver en større mængde udtrykt antigen, hvilket fører til en stor stigning i specifikke CTL -responser.

Prime-boost-strategier har haft succes med at fremkalde beskyttelse mod malariaudfordring i en række undersøgelser. Primede mus med plasmid-DNA, der koder for Plasmodium yoelii circumsporozoite overfladeprotein (PyCSP), derefter boostet med et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker det samme protein, havde signifikant højere niveauer af antistof, CTL-aktivitet og IFN-γ og dermed højere beskyttelsesniveauer end mus immuniseret og boostet med plasmid -DNA alene. Dette kan forstærkes yderligere ved priming med en blanding af plasmider, der koder for PyCSP og murint GM-CSF, inden boosting med rekombinant vacciniavirus. En effektiv prime-boost-strategi for den simianske malaria model P. knowlesi er også blevet påvist. Rhesus-aber blev primet med en multikomponent, flertrins-DNA-vaccine, der koder for to levertrin-antigener-circumsporozoite-overfladeproteinet (PkCSP) og sporozoit-overfladeprotein 2 (PkSSP2)-og to blodtrinnsantigener-det apikale merozoite-overfladeprotein 1 (PkAMA1) og merozoitoverfladeprotein 1 (PkMSP1p42). De blev derefter boostet med et rekombinant canarypox-virus, der koder for alle fire antigener (ALVAC-4). Immuniserede aber udviklede antistoffer mod sporozoitter og inficerede erythrocytter og IFN-γ-udskillende T-celle-responser mod peptider fra PkCSP. Delvis beskyttelse mod sporozoit -udfordring blev opnået, og middel parasitæmi var signifikant reduceret sammenlignet med kontrolaber. Disse modeller, selvom de ikke er ideelle til ekstrapolering til P. falciparum hos mennesker, vil være vigtige i prækliniske forsøg.

Forbedring af immunrespons

DNA

Effektiviteten af ​​DNA-immunisering kan forbedres ved at stabilisere DNA mod nedbrydning og øge effektiviteten af ​​levering af DNA til antigenpræsenterende celler . Dette er blevet påvist ved at belægge bionedbrydelige kationiske mikropartikler (såsom poly (lactid-co-glycolid) formuleret med cetyltrimethylammoniumbromid ) med DNA. Sådanne DNA-overtrukne mikropartikler kan være lige så effektive til at øge CTL som rekombinante vira, især når de blandes med alun. Partikler på 300 nm i diameter synes at være mest effektive til optagelse af antigenpræsenterende celler.

Alphavirus vektorer

Rekombinante alphavirus-baserede vektorer er blevet brugt til at forbedre DNA-vaccinationseffektiviteten. Genet, der koder for antigenet af interesse, indsættes i alphavirus-replikonen og erstatter strukturelle gener, men efterlader ikke-strukturelle replikasegener intakte. Den Sindbis virus og Semliki Forest-virus er blevet brugt til at bygge rekombinante alfavirus replikoner . I modsætning til konventionelle DNA -vaccinationer dræber alfavirusvektorer transficerede celler og udtrykkes kun forbigående. Alphavirus -replikasegener udtrykkes ud over vaccinationsindsatsen. Det er ikke klart, hvordan alphavirusreplikoner øger et immunrespons, men det kan skyldes de høje proteinniveauer, der udtrykkes af denne vektor, replikoninducerede cytokinresponser eller replikoninducerede apoptose, der fører til forbedret antigenoptagelse af dendritiske celler.

Se også

• Vektor DNA
• HIV -vaccine
• Genterapi
• RNA -vaccine

Referencer

Yderligere læsning

Scholia har en profil for DNA -vaccine (Q578537) .