Fusionsprotein - Fusion protein
Fusionsproteiner eller kimære (kī-ˈmir-ik) proteiner (bogstaveligt talt fremstillet af dele fra forskellige kilder) er proteiner skabt ved sammenføjning af to eller flere gener, der oprindeligt kodede for separate proteiner. Oversættelse af dette fusionsgen resulterer i et enkelt eller flere polypeptider med funktionelle egenskaber afledt af hvert af de originale proteiner. Rekombinante fusionsproteiner fremstilles kunstigt ved hjælp af rekombinant DNA -teknologi til brug i biologisk forskning eller terapeutik . Kimær eller kimære betegner normalt hybridproteiner fremstillet af polypeptider med forskellige funktioner eller fysisk-kemiske mønstre. Kimære mutante proteiner forekommer naturligt, når en kompleks mutation , såsom en kromosomal translokation , tandemduplikation eller retrotransposition, skaber en ny kodende sekvens, der indeholder dele af de kodende sekvenser fra to forskellige gener. Naturligt forekommende fusionsproteiner findes almindeligvis i kræftceller, hvor de kan fungere som onkoproteiner . Den bcr-abl-fusionsprotein er et velkendt eksempel på et onkogent fusionsprotein, og anses for at være den primære onkogene føreren af kronisk myeloid leukæmi .
Funktioner
Nogle fusionsproteiner kombinerer hele peptider og indeholder derfor alle funktionelle domæner for de originale proteiner. Andre fusionsproteiner, især dem, der forekommer naturligt, kombinerer imidlertid kun dele af kodende sekvenser og opretholder derfor ikke de oprindelige funktioner for de forældrenes gener, der dannede dem.
Mange hele genfusioner er fuldt funktionsdygtige og kan stadig fungere som erstatning for de originale peptider. Nogle oplever imidlertid interaktioner mellem de to proteiner, der kan ændre deres funktioner. Ud over disse effekter kan nogle genfusioner forårsage regulatoriske ændringer, der ændrer, hvornår og hvor disse gener virker. Ved delvise genfusioner har blanding af forskellige aktive steder og bindingsdomæner potentialet til at resultere i nye proteiner med nye funktioner.
Fluorescerende proteintag
Sammensmeltning af fluorescerende mærker til proteiner i en værtscelle er en meget populær teknik, der bruges i eksperimentel celle- og biologiforskning for at spore proteininteraktioner i realtid. Det første fluorescerende mærke, grønt fluorescerende protein (GFP), blev isoleret fra Aequorea Victoria og bruges stadig hyppigt i moderne forskning. Nyere afledninger inkluderer fotokonverterbare fluorescerende proteiner (PCFP'er), som først blev isoleret fra Anthozoa . Den mest almindeligt anvendte PCFP er Kaede fluorescerende mærke, men udviklingen af Kikume grøn-rød (KikGR) i 2005 giver et lysere signal og mere effektiv fotokonvertering. Fordelen ved at bruge PCFP fluorescerende tags er muligheden for at spore interaktionen mellem overlappende biokemiske veje i realtid. Mærket ændrer farve fra grønt til rødt, når proteinet når et interessepunkt i vejen, og det alternative farvede protein kan overvåges gennem vejen. Denne teknik er især nyttig, når man studerer genanvendelsesveje til G-proteinkoblede receptorer (GPCR). Skæbnen for genbrugte G-proteinreceptorer kan enten sendes til plasmamembranen, der skal genanvendes, markeret med et grønt fluorescerende mærke eller kan sendes til et lysosom til nedbrydning, markeret med et rødt fluorescerende mærke.
Kimære proteinlægemidler
Formålet med at skabe fusionsproteiner i lægemiddeludvikling er at bibringe egenskaber fra hvert af "forælder" -proteinerne til det resulterende kimære protein. Adskillige kimære protein narkotika er i øjeblikket tilgængelige til medicinsk brug.
Mange kimære proteinlægemidler er monoklonale antistoffer, hvis specificitet for et målmolekyle blev udviklet ved hjælp af mus og derfor oprindeligt var "mus" -antistoffer. Som ikke-humane proteiner har museantistoffer en tendens til at fremkalde en immunreaktion, hvis de administreres til mennesker. Chimeriseringsprocessen indebærer konstruktion af udskiftning af segmenter af antistofmolekylet, der adskiller det fra et humant antistof. For eksempel kan menneskelige konstante domæner introduceres, hvorved de fleste af de potentielt immunogene dele af lægemidlet elimineres uden at ændre dets specificitet for det tilsigtede terapeutiske mål. Antistofnomenklatur angiver denne form for ændring ved at indsætte -xi- i det ikke-proprietære navn (f.eks. Abci- xi -mab ). Hvis dele af de variable domæner også erstattes af humane portioner, opnås humaniserede antistoffer. Selvom den ikke er konceptuelt adskilt fra kimærer, er denne type angivet ved hjælp af -zu- såsom i dacli- zu -mab . Se listen over monoklonale antistoffer for flere eksempler.
Ud over kimære og humaniserede antistoffer er der andre farmaceutiske formål til dannelse af kimære konstruktioner. Etanercept er for eksempel en TNFα -blokker, der er skabt gennem kombinationen af en tumornekrosefaktorreceptor (TNFR) med immunoglobulin G 1 Fc -segmentet . TNFR tilvejebringer specificitet for lægemiddelmålet, og antistoffets Fc -segment menes at tilføre lægemidlet stabilitet og leveringsdygtighed. Yderligere kimære proteiner, der anvendes til terapeutiske anvendelser, omfatter:
- Aflibercept : Et humant rekombinant protein, der hjælper med behandling af oxaliplatinresistent metastatisk kolorektal cancer , neo-vaskulær makuladegeneration og makulaødem .
- Rilonacept : Reducerer inflammation ved at forhindre aktivering af IL-1-receptorer til behandling af kryopyrinassocierede periodiske syndromer (CAPS).
- Alefacept : Regulerede T-cellersvar ved selektivt at målrette effektorhukommelses-T-celler til behandling af psoriasis vulgaris .
- Romiplostim : Et peptistof, der behandler immuntrombocytopeni .
- Abatacept / Belatacept : Forstyrrer co-stimulering af T-celler til behandling af autoimmune lidelser som leddegigt , psoriasisartritis og psoriasis .
- Denileukin-diftitox : Behandler kutant lymfom .
Rekombinant teknologi
Et rekombinant fusionsprotein er et protein skabt ved genteknologi af et fusionsgen. Dette involverer typisk fjernelse af stopkodonet fra en cDNA -sekvens, der koder for det første protein, og derefter tilføjer cDNA -sekvensen for det andet protein i rammen gennem ligering eller overlapning af forlængelses -PCR . Denne DNA -sekvens vil derefter blive udtrykt af en celle som et enkelt protein. Proteinet kan konstrueres til at omfatte hele sekvensen af begge originale proteiner eller kun en del af begge.
Hvis de to enheder er proteiner, tilføjes ofte også linker (eller "spacer") peptider, hvilket gør det mere sandsynligt, at proteinerne foldes uafhængigt og opfører sig som forventet. Især i det tilfælde, hvor linkerne muliggør proteinrensning , bliver linkere i protein- eller peptidfusioner undertiden konstrueret med spaltningssteder for proteaser eller kemiske midler, der muliggør frigivelse af de to separate proteiner. Denne teknik bruges ofte til identifikation og oprensning af proteiner ved at fusionere et GST-protein , FLAG-peptid eller et hexa-his-peptid (6xHis-tag), som kan isoleres ved hjælp af affinitetskromatografi med nikkel- eller koboltharpikser. Di- eller multimere kimære proteiner kan fremstilles ved genteknologi ved fusion til de originale proteiner i peptiddomæner, der inducerer kunstig proteindi- eller multimerisering (f.eks. Streptavidin eller leucin-lynlåse ). Fusionsproteiner kan også fremstilles med toksiner eller antistoffer knyttet til dem for at studere sygdomsudvikling. Hydrogenase-promotor, P SH , blev undersøgt ved konstruktion af en P SH- promotor- gfp- fusion ved anvendelse af grønt fluorescerende protein ( gfp) reportergen .
Rekombinant funktionalitet
Nye rekombinante teknologier har gjort det muligt at forbedre fusionsproteindesign til brug på så forskellige områder som biodetektion, papir- og fødevareindustri og biofarmaka. Nylige forbedringer har involveret fusion af enkeltpeptider eller proteinfragmenter til områder af eksisterende proteiner, såsom N- og C -termini , og er kendt for at øge følgende egenskaber:
- Katalytisk effektivitet : Fusion af visse peptider muliggør større katalytisk effektivitet ved at ændre målproteinets tertiære og kvaternære struktur .
- Opløselighed : En fælles udfordring i fusionsproteindesign er spørgsmålet om uopløselighed af nyligt syntetiserede fusionsproteiner i den rekombinante vært, hvilket fører til en over-aggregering af målproteinet i cellen. Molekylære chaperoner, der er i stand til at hjælpe med proteinfoldning, kan tilføjes og derved bedre adskille hydrofobe og hydrofile interaktioner i det opløste stof for at øge proteinopløseligheden.
- Termostabilitet : Enkeltpeptider eller proteinfragmenter tilsættes typisk for at reducere fleksibiliteten af enten N- eller C -enden af målproteinet, hvilket forstærker termostabiliteten og stabiliserer pH -området .
- Enzymaktivitet: Fusion, der involverer introduktion af hydrogenbindinger, kan bruges til at udvide den samlede enzymaktivitet.
- Ekspressionsniveauer: Tilføjelse af talrige fusionsfragmenter, såsom maltosebindende protein (MBP) eller lille ubiquitinlignende molekyle ( SUMO ), tjener til at forbedre enzymekspression og udskillelse af målproteinet.
- Immobilisering: PHA -syntase, et enzym, der muliggør immobilisering af proteiner af interesse, er et vigtigt fusionsmærke i industriel forskning.
- Krystalkvalitet: Krystalkvalitet kan forbedres ved at tilføje kovalente forbindelser mellem proteiner og hjælpe med strukturbestemmelsesteknikker.
Rekombinant proteindesign
De tidligste anvendelser af rekombinant proteindesign kan dokumenteres ved anvendelse af enkeltpeptidmærker til oprensning af proteiner ved affinitetskromatografi . Siden da er en række forskellige fusionsproteindesignteknikker blevet udviklet til applikationer lige så forskellige som fluorescerende proteintags til rekombinante fusionsproteinlægemidler. Tre almindeligt anvendte designteknikker omfatter tandemfusion, domæneindsættelse og post-translationel konjugering.
Tandem fusion
Proteinerne af interesse er simpelthen forbundet ende-til-ende via fusion af N- eller C-terminaler mellem proteinerne. Dette giver en fleksibel brostruktur, der giver nok plads mellem fusionspartnere til at sikre korrekt foldning . Imidlertid er peptidets N- eller C-terminaler ofte afgørende komponenter for at opnå det ønskede foldemønster for det rekombinante protein, hvilket gør enkel ende-til-ende-sammenføjning af domæner ineffektiv i dette tilfælde. Af denne grund er en proteinlinker ofte nødvendig for at opretholde funktionaliteten af proteindomæner af interesse.
Indsætning af domæne
Denne teknik involverer fusion af på hinanden følgende proteindomæner ved at kode ønskede strukturer i en enkelt polypeptidkæde, men kan undertiden kræve indsættelse af et domæne inden for et andet domæne. Denne teknik betragtes typisk som vanskeligere at udføre end tandemfusion på grund af vanskeligheder med at finde et passende ligeringssted i genet af interesse.
Post-translationel konjugering
Denne teknik smelter proteindomæner efter ribosomal translation af proteinerne af interesse i modsætning til genetisk fusion før translation anvendt i andre rekombinante teknologier.
Protein Linkers
Proteinlinkere hjælper fusionsproteindesign ved at tilvejebringe passende afstand mellem domæner og understøtte korrekt proteinfoldning i tilfælde af, at N- eller C -termini -interaktioner er afgørende for foldning. Almindeligvis tillader proteinlinkere vigtige domæneinteraktioner, forstærker stabiliteten og reducerer sterisk hindring, hvilket gør dem foretrukne til brug i fusionsproteindesign, selv når N og C -terminaler kan fusioneres. Tre hovedtyper af linkere er fleksible, stive og in vivo spaltbare.
- Fleksible linkere kan bestå af mange små glycinrester , hvilket giver dem mulighed for at krølle til en dynamisk, tilpasselig form.
- Stive linkere kan dannes af store, cykliske prolinrester , hvilket kan være nyttigt, når meget specifik afstand mellem domæner skal opretholdes.
- In vivo -spaltbare linkere er unikke ved, at de er designet til at tillade frigivelse af et eller flere fusionerede domæner under visse reaktionsbetingelser, såsom en specifik pH -gradient, eller når de kommer i kontakt med et andet biomolekyle i cellen.
Naturlig forekomst
Naturligt forekommende fusionsgener skabes oftest, når en kromosomal translokation erstatter de terminale exoner af et gen med intakte exoner fra et andet gen. Dette skaber et enkelt gen, der kan transkriberes , splejses og oversættes til at producere et funktionelt fusionsprotein. Mange vigtige cancer -fremme onkogener er fusionsgener fremstillet på denne måde.
Eksempler omfatter:
Antistoffer er fusionsproteiner produceret ved V (D) J rekombination .
Der er også sjældne eksempler på naturligt forekommende polypeptider, der ser ud til at være en fusion af to klart definerede moduler, hvor hvert modul viser sin karakteristiske aktivitet eller funktion, uafhængigt af det andet. To hovedeksempler er: dobbelt PP2C-kimære i Plasmodium falciparum (malariaparasitten), hvor hvert PP2C-modul udviser proteinphosphatase 2C enzymatisk aktivitet, og de dobbeltfamilieimmunofiliner, der forekommer i en række encellede organismer (såsom protozoanparasitter og Flavobacteria ) og indeholder Cyclophilin- og FKBP-chaperonmoduler i fuld længde. Den kimæres evolutionære oprindelse er stadig uklar.
Se også
Referencer
eksterne links
|
Biblioteksressourcer om Fusion -protein |
- Mutant+kimærisk+proteiner ved US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
- ChiPPI : Serverprotein-protein-interaktionen af kimære proteiner.