Dihydrofolatreduktase - Dihydrofolate reductase
| Dihydrofolatreduktase | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Krystalstruktur af kyllingeleverdihydrofolatreduktase. PDB -indtastning 8dfr
| |||||||||
| Identifikatorer | |||||||||
| EF -nr. | 1.5.1.3 | ||||||||
| CAS -nr. | 9002-03-3 | ||||||||
| Databaser | |||||||||
| IntEnz | IntEnz -visning | ||||||||
| BRENDA | BRENDA indgang | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme udsigt | ||||||||
| KEGG | KEGG -indtastning | ||||||||
| MetaCyc | metabolisk vej | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| PDB -strukturer | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Genontologi | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
| Dihydrofolatreduktase | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identifikatorer | |||||||||
| Symbol | DHFR_1 | ||||||||
| Pfam | PF00186 | ||||||||
| Pfam klan | CL0387 | ||||||||
| InterPro | IPR001796 | ||||||||
| PROSIT | PDOC00072 | ||||||||
| SCOP2 | 1dhi / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
| R67 dihydrofolatreduktase | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Højopløselig struktur af en plasmidkodet dihydrofolatreduktase fra E.coli . PDB -indtastning 2gqv
| |||||||||
| Identifikatorer | |||||||||
| Symbol | DHFR_2 | ||||||||
| Pfam | PF06442 | ||||||||
| InterPro | IPR009159 | ||||||||
| SCOP2 | 1vif / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
Dihydrofolatreduktase , eller DHFR , er et enzym, der reducerer dihydrofolinsyre til tetrahydrofolinsyre ved hjælp af NADPH som elektrondonor , som kan omdannes til de typer tetrahydrofolat- kofaktorer, der anvendes i 1-carbon-overførselskemi. Hos mennesker kodes DHFR -enzymet af DHFR -genet . Det findes i q11 → q22 regionen af kromosom 5. Bakterielle arter besidder distinkte DHFR enzymer (baseret på deres bindingsmønster diaminoheterocyclic molekyler), men mammale DHFRs er meget ens.
Struktur
Et centralt otte-strenget beta-plisseret ark udgør hovedtrækket ved polypeptid- rygraden i DHFR. Syv af disse tråde er parallelle, og den ottende kører antiparallel. Fire alfa -spiraler forbinder successive beta -strenge. Rester 9 - 24 betegnes "Met20" eller "loop 1" og er sammen med andre sløjfer en del af det store underdomæne, der omgiver det aktive sted . Det aktive sted er beliggende i den N -terminale halvdel af sekvensen, som omfatter et konserveret Pro - Trp dipeptid; den tryptophan er blevet vist at være involveret i bindingen af substratet med enzymet.
Human DHFR med bundet dihydrofolat og NADPH
Fungere
Dihydrofolatreduktase omdanner dihydrofolat til tetrahydrofolat , en protontransport , der kræves til de novo -syntese af puriner , thymidylsyre og visse aminosyrer . Mens det funktionelle dihydrofolatreduktasegen er blevet kortlagt til kromosom 5, er flere intronløse behandlede pseudogener eller dihydrofolatreduktase-lignende gener blevet identificeret på separate kromosomer.
Reaktion katalyseret af DHFR.
Tetrahydrofolatsyntesebane.
Fundet i alle organismer har DHFR en afgørende rolle i at regulere mængden af tetrahydrofolat i cellen. Tetrahydrofolat og dets derivater er afgørende for purin- og thymidylatsyntese , som er vigtige for celleproliferation og cellevækst. DHFR spiller en central rolle i syntesen af nukleinsyreforstadier , og det har vist sig, at mutante celler, der fuldstændig mangler DHFR, kræver glycin, en aminosyre og thymidin for at vokse. DHFR er også blevet påvist som et enzym involveret i bjærgningen af tetrahydrobiopterin fra dihydrobiopterin
Mekanisme
Generel mekanisme
DHFR katalyserer overførslen af et hydrid fra NADPH til dihydrofolat med en ledsagende protonation til fremstilling af tetrahydrofolat . Til sidst reduceres dihydrofolat til tetrahydrofolat, og NADPH oxideres til NADP+ . Den høje fleksibilitet af Met20 og andre sløjfer i nærheden af det aktive sted spiller en rolle i at fremme frigivelsen af produktet, tetrahydrofolat. Især Met20 -sløjfen hjælper med at stabilisere nicotinamidringen i NADPH for at fremme overførslen af hydridet fra NADPH til dihydrofolat.
.png)
Mekanismen for dette enzym er trinvis og steady-state tilfældig. Specifikt begynder den katalytiske reaktion med, at NADPH og substratet fastgøres til enzymets bindingssted efterfulgt af protonation og hydridoverførsel fra cofaktoren NADPH til substratet. To sidstnævnte trin finder imidlertid ikke sted samtidigt i samme overgangstilstand. I en undersøgelse ved hjælp af beregningsmæssige og eksperimentelle tilgange konkluderer Liu et al. , At protonationstrinnet går forud for hydridoverførslen.
DHFRs enzymatiske mekanisme er vist at være pH -afhængig, især hydridoverførselstrinnet, da pH -ændringer har vist sig at have en bemærkelsesværdig indflydelse på elektrostatikken på det aktive sted og ioniseringstilstanden af dets rester. Surhedsgraden af det målrettede nitrogen på substratet er vigtig ved binding af substratet til enzymets bindingssted, som har vist sig at være hydrofobt, selvom det har direkte kontakt med vand. Asp27 er den eneste ladede hydrofile rest i bindingsstedet, og neutralisering af ladningen på Asp27 kan ændre enzymets pKa. Asp27 spiller en kritisk rolle i den katalytiske mekanisme ved at hjælpe med protonering af substratet og fastholde substratet i den konformation, der er gunstig for hydridoverførslen. Protonationstrinnet er vist at være forbundet med enol tautomerisering, selvom denne omdannelse ikke anses for gunstig for protondonationen. Et vandmolekyle har vist sig at være involveret i protonationstrinnet. Indføring af vandmolekylet til enzymets aktive sted lettes af Met20 -sløjfen.
Konformationsændringer af DHFR
Den katalytiske cyklus af reaktionen katalyseret af DHFR indeholder fem vigtige mellemprodukter: holoenzym (E: NADPH), Michaelis -kompleks (E: NADPH: DHF), ternært produktkompleks (E: NADP + : THF), tetrahydrofolat binært kompleks (E: THF) ) og THF‚NADPH -kompleks (E: NADPH: THF). Produktets (THF) dissociationstrin fra E: NADPH: THF til E: NADPH er det hastighedsbestemmende trin under steady-state omsætning.
Konformationsændringer er kritiske i DHFRs katalytiske mekanisme. Met20 loop af DHFR er i stand til at åbne, lukke eller lukke det aktive sted. Tilsvarende er tre forskellige konformationer klassificeret som de åbne, lukkede og lukkede tilstande tildelt Met20. Derudover blev en ekstra forvrænget konformation af Met20 defineret på grund af dets utydelige karakteriseringsresultater. Met20 -sløjfen observeres i sin okkluderede konformation i de tre produkt -ligerende mellemprodukter, hvor nicotinamidringen er okkluderet fra det aktive sted. Denne konformationsfunktion tegner sig for, at substitutionen af NADP + med NADPH er forud for produktdissociation. Således kan den næste reaktionsrunde forekomme ved binding af substrat.
R67 DHFR
På grund af sin unikke struktur og katalytiske egenskaber studeres R67 DHFR bredt. R67 DHFR er en type II R-plasmid-kodet DHFR uden genetisk og strukturelt forhold til E. coli kromosomalt DHFR. Det er en homotetramer, der besidder 222 symmetrien med en enkelt aktiv site -pore, der udsættes for opløsningsmiddel [null.] Denne symmetri af det aktive sted resulterer i enzymets forskellige bindingsmetode: Den kan binde med to dihydrofolat (DHF) molekyler med positiv kooperativitet eller to NADPH -molekyler med negativ kooperativitet, eller et substrat plus et, men kun sidstnævnte har den katalytiske aktivitet. Sammenlign med E. coli kromosomalt DHFR, har det højere K m i binding dihydrofolat (DHF) og NADPH. Den meget lavere katalytiske kinetik viser, at hydridoverførsel er hastighedsbestemmende trin i stedet for produkt (THF) frigivelse.
I R67 DHFR -strukturen danner homotetrameren en aktiv stedspore. I den katalytiske proces kommer DHF og NADPH ind i poren fra modsat position. Π-π-stablingsinteraktionen mellem NADPHs nicotinamidring og DHF's pteridinring forbinder tæt to reaktanter i det aktive sted. Fleksibiliteten af p-aminobenzoylglutamathale af DHF blev imidlertid observeret ved binding, hvilket kan fremme dannelsen af overgangstilstanden.
Klinisk betydning
Dihydrofolatreduktasemangel er blevet forbundet med megaloblastisk anæmi . Behandlingen er med reducerede former for folsyre. Fordi tetrahydrofolat, produktet af denne reaktion, er den aktive form for folat hos mennesker, kan hæmning af DHFR forårsage funktionel folatmangel . DHFR er et attraktivt farmaceutisk mål for inhibering på grund af dets afgørende rolle i DNA -precursorsyntese. Trimethoprim , et antibiotikum , hæmmer bakteriel DHFR, mens methotrexat , et kemoterapimiddel , hæmmer DHFR fra pattedyr. Imidlertid har resistens udviklet sig mod nogle lægemidler som følge af mutationsændringer i selve DHFR.
DHFR -mutationer forårsager en sjælden autosomal recessiv medfødt fejl ved folatmetabolisme, der resulterer i megaloblastisk anæmi , pancytopeni og alvorlig cerebral folatmangel, som kan korrigeres ved tilskud af folinsyre .
Terapeutiske anvendelser
Da folat er nødvendig ved hurtigt delende celler for at fremstille thymin , kan denne effekt anvendes til terapeutisk fordel.
DHFR kan målrettes i behandlingen af kræft og som et potentielt mål mod bakterielle infektioner. DHFR er ansvarlig for niveauerne af tetrahydrofolat i en celle, og hæmningen af DHFR kan begrænse vækst og spredning af celler, der er karakteristiske for kræft og bakterielle infektioner. Methotrexat , en konkurrencedygtig hæmmer af DHFR, er et sådant lægemiddel mod kræft, der hæmmer DHFR. Andre lægemidler omfatter trimethoprim og pyrimethamin . Disse tre er meget udbredt som antitumor og antimikrobielle midler. Andre klasser af forbindelser, der er målrettet mod DHFR generelt, og bakterielle DHFR'er i særdeleshed, tilhører klasserne såsom diaminopteridiner, diaminotriaziner, diaminopyrroloquinazoliner, stilbener, chalcones, deoxybenzoiner, for blot at nævne nogle få.
Trimethoprim har vist sig at have aktivitet mod en række grampositive bakterielle patogener. Imidlertid kan resistens over for trimethoprim og andre lægemidler rettet mod DHFR opstå på grund af en række mekanismer, der begrænser succesen med deres terapeutiske anvendelser. Resistens kan blandt andet opstå fra DHFR -genamplifikation, mutationer i DHFR, fald i optagelsen af lægemidlerne. Uanset hvad, har trimethoprim og sulfamethoxazol i kombination været brugt som et antibakterielt middel i årtier.
Folat er nødvendigt for vækst, og vejen til metabolisme af folat er et mål i udviklingen af behandlinger mod kræft. DHFR er et sådant mål. Et regime med fluorouracil , doxorubicin og methotrexat viste sig at forlænge overlevelsen hos patienter med fremskreden mavekræft. Yderligere undersøgelser af hæmmere af DHFR kan føre til flere måder at behandle kræft på.
Bakterier har også brug for DHFR for at vokse og formere sig, og derfor har inhibitorer, der er selektive for bakterielle DHFR, fundet anvendelse som antibakterielle midler.
Klasser af små molekyler, der anvendes som hæmmere af dihydrofolatreduktase, omfatter diaminoquinazolin og diaminopyrroloquinazolin, diaminopyrimidin, diaminopteridin og diaminotriaziner.
Potentiel miltbrandbehandling
Dihydrofolatreduktase fra Bacillus anthracis (BaDHFR) et valideret lægemiddelmål i behandlingen af den infektionssygdom, miltbrand. BaDHFR er mindre følsom over for trimethoprim -analoger end dihydrofolatreduktase fra andre arter, såsom Escherichia coli , Staphylococcus aureus og Streptococcus pneumoniae . En strukturel opstilling af dihydrofolatreduktase fra alle fire arter viser, at kun BaDHFR har kombinationen phenylalanin og tyrosin i henholdsvis position 96 og 102.
BaDHFR's resistens over for trimethoprimanaloger skyldes disse to rester (F96 og Y102), som også giver forbedret kinetik og katalytisk effektivitet. Aktuel forskning bruger aktive stedmutanter i BaDHFR til at guide blyoptimering for nye antifolathæmmere.
Som et forskningsværktøj
DHFR er blevet brugt som et værktøj til at påvise protein-protein-interaktioner i et protein-fragment-komplementeringsassay (PCA).
CHO -celler
DHFR mangler CHO -celler er den mest almindeligt anvendte cellelinje til produktion af rekombinante proteiner. Disse celler transficeres med et plasmid, der bærer dhfr- genet og genet for det rekombinante protein i et enkelt ekspressionssystem , og udsættes derefter for selektive betingelser i thymidin-manglende medium . Kun cellerne med det eksogene DHFR -gen sammen med genet af interesse overlever.
Interaktioner
Dihydrofolatreduktase har vist sig at interagere med GroEL og Mdm2 .
Interaktivt vejkort
Klik på gener, proteiner og metabolitter herunder for at linke til respektive artikler.
Referencer
Yderligere læsning
- Joska TM, Anderson AC (oktober 2006). "Struktur-aktivitetsforhold mellem Bacillus cereus og Bacillus anthracis dihydrofolatreduktase: mod identifikation af nye potente lægemiddelledninger" . Antimikrobielle midler og kemoterapi . 50 (10): 3435–43. doi : 10.1128/AAC.00386-06 . PMC 1610094 . PMID 17005826 .
- Chan DC, Fu H, Forsch RA, Queener SF, Rosowsky A (juni 2005). "Design, syntese og antifolataktivitet af nye analoger af piritrexim og andre diaminopyrimidindihydrofolatreduktasehæmmere med omega-carboxyalkoxy eller omega-carboxy-1-alkynyl-substitution i sidekæden". Journal of Medicinal Chemistry . 48 (13): 4420–31. doi : 10.1021/jm0581718 . PMID 15974594 .
- Banerjee D, Mayer-Kuckuk P, Capiaux G, Budak-Alpdogan T, Gorlick R, Bertino JR (juli 2002). "Nye aspekter af resistens over for lægemidler målrettet dihydrofolatreduktase og thymidylatsyntase" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molekylært sygdomsgrundlag . 1587 (2–3): 164–73. doi : 10.1016/S0925-4439 (02) 00079-0 . PMID 12084458 .
- Stockman BJ, Nirmala NR, Wagner G, Delcamp TJ, DeYarman MT, Freisheim JH (januar 1992). "Sekvensspecifikke 1H og 15N resonansopgaver for human dihydrofolatreduktase i opløsning". Biokemi . 31 (1): 218–29. doi : 10.1021/bi00116a031 . PMID 1731871 .
- Beltzer JP, Spiess M (december 1991). "In vitro -binding af asialoglycoproteinreceptoren til beta -adaptin af plasmamembranbelagte vesikler" . EMBO Journal . 10 (12): 3735–42. doi : 10.1002/j.1460-2075.1991.tb04942.x . PMC 453108 . PMID 1935897 .
- Davies JF, Delcamp TJ, Prendergast NJ, Ashford VA, Freisheim JH, Kraut J (oktober 1990). "Krystalstrukturer af rekombinant humant dihydrofolatreduktase kompleksbundet med folat og 5-deazafolat". Biokemi . 29 (40): 9467–79. doi : 10.1021/bi00492a021 . PMID 2248959 .
- Will CL, Dolnick BJ (december 1989). "5-Fluorouracil inhiberer dihydrofolatreduktase-precursor-mRNA-behandling og/eller nuklear mRNA-stabilitet i methotrexatresistente KB-celler" . Journal of Biological Chemistry . 264 (35): 21413–21. doi : 10.1016/S0021-9258 (19) 30096-1 . PMID 2592384 .
- Masters JN, Attardi G (marts 1985). "Diskrete humane dihydrofolatreduktase -gen -transkripter til stede i polysomalt RNA -kort med deres 5' -ender flere hundrede nukleotider opstrøms for hoved -mRNA -startstedet" . Molekylær og cellulær biologi . 5 (3): 493–500. doi : 10.1128/mcb.5.3.493 . PMC 366741 . PMID 2859520 .
- Miszta H, Dabrowski Z, Lanotte M (november 1988). "In vitro -mønstre af enzymatisk tetrahydrofolat dehydrogenase (EC 1.5.1.3) udtryk i knoglemarvstromaceller". Leukæmi . 2 (11): 754–9. PMID 3185016 .
- Oefner C, D'Arcy A, Winkler FK (juni 1988). "Krystalstruktur af human dihydrofolatreduktase kompleksbundet med folat" . European Journal of Biochemistry / FEBS . 174 (2): 377–85. doi : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb14108.x . PMID 3383852 .
- Yang JK, Masters JN, Attardi G (juni 1984). "Human dihydrofolatreduktase-genorganisation. Omfattende bevarelse af den G + C-rige 5 'ikke-kodende sekvens og stærk intronstørrelsesdivergens fra homologe pattedyrgener". Journal of Molecular Biology . 176 (2): 169–87. doi : 10.1016/0022-2836 (84) 90419-4 . PMID 6235374 .
- Masters JN, Yang JK, Cellini A, Attardi G (juni 1983). "Et humant dihydrofolatreduktase -pseudogent og dets forhold til flere former for specifikt messenger -RNA". Journal of Molecular Biology . 167 (1): 23–36. doi : 10.1016/S0022-2836 (83) 80032-1 . PMID 6306253 .
- Chen MJ, Shimada T, Moulton AD, Cline A, Humphries RK, Maizel J, Nienhuis AW (marts 1984). "Det funktionelle humane dihydrofolatreduktase -gen" . Journal of Biological Chemistry . 259 (6): 3933–43. doi : 10.1016/S0021-9258 (17) 43186-3 . PMID 6323448 .
- Funanage VL, Myoda TT, Moses PA, Cowell HR (oktober 1984). "Tildeling af det humane dihydrofolatreduktasegen til q11 ---- q22-området i kromosom 5" . Molekylær og cellulær biologi . 4 (10): 2010–6. doi : 10.1128/mcb.4.10.2010 . PMC 369017 . PMID 6504041 .
- Masters JN, Attardi G (1983). "Nukleotidsekvensen af cDNA'et, der koder for den humane dihydrofolinsyre -reduktase". Gene . 21 (1–2): 59–63. doi : 10.1016/0378-1119 (83) 90147-6 . PMID 6687716 .
- Morandi C, Masters JN, Mottes M, Attardi G (april 1982). "Flere former for human dihydrofolatreduktase -messenger -RNA. Kloning og ekspression i Escherichia coli af deres DNA -kodende sekvens". Journal of Molecular Biology . 156 (3): 583–607. doi : 10.1016/0022-2836 (82) 90268-6 . PMID 6750132 .
- Bonifaci N, Sitia R, Rubartelli A (september 1995). "Nuklear translokation af et eksogent fusionsprotein indeholdende HIV Tat kræver udfoldelse". AIDS . 9 (9): 995–1000. doi : 10.1097/00002030-199509000-00003 . PMID 8527095 . S2CID 8417864 .
- Mayhew M, da Silva AC, Martin J, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Hartl FU (februar 1996). "Proteinfoldning i det centrale hulrum i GroEL-GroES-chaperoninkomplekset". Natur . 379 (6564): 420–6. Bibcode : 1996Natur.379..420M . doi : 10.1038/379420a0 . PMID 8559246 . S2CID 4310511 .
- Gross M, Robinson CV, Mayhew M, Hartl FU, Radford SE (december 1996). "Betydelig hydrogenudvekslingsbeskyttelse i GroEL-bundet DHFR opretholdes under iterative runder af substratcykling" . Proteinvidenskab . 5 (12): 2506–13. doi : 10.1002/pro.5560051213 . PMC 2143321 . PMID 8976559 .
- Schleiff E, Shore GC, Goping IS (marts 1997). "Human mitokondriel importreceptor, Tom20p. Brug af glutathion til at afsløre specifikke interaktioner mellem Tom20-glutathion S-transferase og mitokondrielle forstadieproteiner". FEBS Breve . 404 (2–3): 314–8. doi : 10.1016/S0014-5793 (97) 00145-2 . PMID 9119086 . S2CID 29177508 .
- Cody V, Galitsky N, Luft JR, Pangborn W, Rosowsky A, Blakley RL (november 1997). "Sammenligning af to uafhængige krystalstrukturer af humane dihydrofolatreduktase-ternære komplekser reduceret med nicotinamid-adenindinucleotidphosphat og den meget tæt-bindende hæmmer PT523". Biokemi . 36 (45): 13897–903. doi : 10.1021/bi971711l . PMID 9374868 .
- Vanguri VK, Wang S, Godyna S, Ranganathan S, Liau G (april 2000). "Thrombospondin-1 binder til polyhistidin med høj affinitet og specificitet" . Den biokemiske journal . 347 (Pt 2): 469–73. doi : 10.1042/0264-6021: 3470469 . PMC 1220979 . PMID 10749676 .
eksterne links
- 1988 Nobelforedrag i medicin
- Proteopedia: Dihydrofolatreduktase
- Oversigt over alle de tilgængelige strukturoplysninger i FBF for UniProt : P00374 (Dihydrofolatreduktase) på PDBe-KB .
