Murin respirovirus -Murine respirovirus

Murint respirovirus
Virusklassificering
(uden rangering):	Virus
Rige :	Riboviria
Kongerige:	Orthornavirae
Phylum:	Negarnaviricota
Klasse:	Monjiviricetes
Bestille:	Mononegavirales
Familie:	Paramyxoviridae
Slægt:	Respirovirus
Arter:	Murint respirovirus
Synonymer
Sendai virus

Sendai -virusposition i Paramyxoviridae fylogenetiske træ

Murint respirovirus , tidligere Sendai-virus (SeV) og tidligere også kendt som murint parainfluenza-virus type 1 eller hæmagglutinerende virus i Japan (HVJ), er et indhyllet , 150-200 nm i diameter, en negativ sans, enkeltstrenget RNA-virus af familie Paramyxoviridae . Det inficerer typisk gnavere, og det er ikke patogent for mennesker eller husdyr. Sendai -virus (SeV) er medlem af slægten Respirovirus . Virussen blev isoleret i byen Sendai i Japan i begyndelsen af ​​1950'erne. Siden da har det været aktivt brugt i forskning som et patogenmodel. Virussen er infektiøs for mange kræftcellelinjer (se nedenfor), har onkolytiske egenskaber påvist i dyremodeller og i naturligt forekommende kræftformer hos dyr. SeVs evne til at fusionere eukaryote celler og danne syncytium blev brugt til at producere hybridomaceller , der var i stand til at fremstille monoklonale antistoffer i store mængder. Nylige anvendelser af SeV-baserede vektorer omfatter omprogrammering af somatiske celler til inducerede pluripotente stamceller og oprettelse af vacciner. Til vaccinationsformål kunne Sendai-virusbaserede konstruktioner leveres i form af næsedråber, hvilket kan være fordelagtigt til at inducere et slimhindeimmunrespons . SeV har flere funktioner, der er vigtige i en vektor for en vellykket vaccine: virussen integreres ikke i værtsgenomet, den undergår ikke genetisk rekombination, den replikerer kun i cytoplasmaet uden DNA -mellemprodukter eller en kernefase, og den forårsager ikke enhver sygdom hos mennesker eller husdyr. Sendai-virus bruges som rygrad til udvikling af vacciner mod Mycobacterium tuberculosis, der forårsager tuberkulose , mod HIV-1, der forårsager AIDS og mod respiratorisk syncytial virus (RSV), der forårsager luftvejsinfektion hos børn. Vaccineudviklingen mod Mycobacterium tuberculosis er i præklinisk fase, mod HIV-1 nåede det fase II kliniske forsøg og mod RSV er det i fase I. Fudan University i samarbejde med ID Pharma Co. Ltd. beskæftiger sig med udvikling af vaccinen til forebyggelse af COVID-19. SeV fungerer som en vaccine -rygradvektor i projektet.

Som infektionsmiddel

SeV -replikation forekommer udelukkende i værtscellens cytoplasma. Virussen bruger sin egen RNA -polymerase. En replikationscyklus tager cirka 12–15 timer med en celle, der giver tusindvis af virioner.

Modtagelige dyr

Virussen er ansvarlig for en meget overførbar luftvejsinfektion hos mus, hamstere, marsvin, rotter og lejlighedsvis murmeldyr, hvor infektion passerer gennem både luft og direkte kontaktveje. Naturlig infektion opstår via luftvejene. I dyrefaciliteter kan luftbåren transmission forekomme over en afstand på 5-6 fod samt gennem luftbehandlingssystemer. Virussen kan påvises i musekolonier verden over, generelt ved amning til unge voksne mus. En undersøgelse i Frankrig rapporterede antistoffer mod SeV i 17% af de undersøgte musekolonier. Epizootiske infektioner hos mus er normalt forbundet med en høj dødelighed, mens enzootiske sygdomsmønstre tyder på, at virussen er latent og kan ryddes i løbet af et år. Sub-dødelig eksponering for SeV kan fremme langvarig immunitet over for yderligere dødelige doser af SeV. Virussen er immunsuppressiv og kan disponere for sekundære bakterielle infektioner. Der er ingen videnskabelige undersøgelser, der blev udført ved hjælp af moderne detektionsmetoder, som ville identificere SeV som en smitsom og dødelig årsagssygdom for mennesker eller husdyr.

Ikke-invasiv bioluminescensbilleddannelse af Sendai-virusinfektion i luftvejene hos levende mus.

Elektronmikroskopi af Sendai -virus

Variabel modtagelighed for infektion i mus- og rotterstammer

Inavlede og udavlede mus- og rotterstammer har meget forskellig modtagelighed over for Sendai -virusinfektion. Visualisering af SeV -infektion i levende dyr viser denne forskel. De testede 129/J mus var cirka 25.000 gange mere følsomme end SJL/J mus. C57BL/6 mus er yderst resistente over for virussen, mens DBA/2J mus er følsomme. C57BL/6 mus viste et let tab af kropsvægt efter SeV -administration, som senere vendte tilbage til det normale. Kun 10% dødelighed blev observeret i C57BL / 6 -mus efter administration af meget høj virulent dosis på 1 * 10 ⁵ TCID50. Det blev vist, at resistens over for de dødelige virkninger af Sendai -virus hos mus er genetisk kontrolleret og udtrykt ved kontrol af viral replikation inden for de første 72 timer efter infektion. Behandling af begge stammer med eksogent IFN før og under virusinfektion førte til en forøgelse af overlevelsestiden i C57BL/6 mus, men alle dyr af begge stammer bukkede i sidste ende under for SeV forårsaget sygdom. Hvis en mus overlever en SeV -infektion, udvikler den en livslang immunitet over for efterfølgende virusinfektioner.

Der er SeV-resistente F344-rotter og modtagelige BN-rotter.

Smitteforløb

I værtsluftvejene når virustiteren et højdepunkt efter 5-6 dage efter infektionsstart, der falder til uopdagelige niveauer ved dag 14. Virussen fremmer en faldende luftvejsinfektion, der begynder i næsepassagerne, passerer gennem luftrøret ind i lungerne og forårsager nekrose af respirationsepitelet. Nekrose er mild i de første par dage med infektion, men blev senere alvorlig ved at toppe omkring dag 5. På dag 9 regenerer cellerne på overfladen af ​​luftvejene. Fokal interstitiel lungebetændelse kan udvikles ledsaget af betændelse og læsioner i forskellige grader på lungerne. Normalt viser luftvejene tegn på helbredelse inden for 3 uger efter infektion, men der kan forekomme resterende læsioner, betændelse eller permanent ardannelse. 6-8 dage efter infektionsstart ser serumantistoffer ud. De forbliver påviselige i cirka 1 år.

Symptomer hos dyr

• Nysning
• Hunched kropsholdning
• Åndedrætsbesvær
• Porphyrinudledning fra øjne og/eller næse
• Sløvhed
• Manglende evne til at trives hos overlevende babyer og unge rotter
• Anoreksi

Diagnose og profylakse

SeV inducerer læsioner i luftvejene, normalt forbundet med bakteriel betændelse i luftrøret og lungen (henholdsvis tracheitis og bronkopneumoni ). Læsionerne er imidlertid begrænsede og er ikke kun vejledende for SeV -infektion. Påvisning gør derfor brug af SeV-specifikke antigener i flere serologiske metoder, herunder ELISA- , immunofluorescens- og hæmagglutinationsassays, med særlig vægt på brugen af ​​ELISA for dets høje følsomhed (i modsætning til hæmagglutinationsassayet ) og dens temmelig tidlige påvisning (i modsætning til immunfluorescensassayet).

I naturlige omgivelser er luftvejsinfektionen af ​​Sendai -virus hos mus akut. Fra ekstrapolering af infektionen af ​​laboratoriemus kan virusets tilstedeværelse først påvises i lungerne 48 til 72 timer efter eksponering. Da virussen replikerer i luftvejene hos en inficeret mus, vokser koncentrationen af ​​virussen hurtigst i løbet af den tredje infektionsdag. Derefter er væksten af ​​virussen langsommere, men konsekvent. Typisk er topkoncentrationen af ​​virussen på den sjette eller syvende dag, og hurtig tilbagegang følger den på den niende dag. Et temmelig kraftigt immunrespons monteret mod virussen er årsagen til dette fald. Den længste periode med påvist tilstedeværelse af viruset i en muselunge er fjorten dage efter infektion.

Eaton et al. oplyser, at ved kontrol af et udbrud af SeV, desinficering af laboratoriemiljøet og vaccination af opdrætterne samt eliminering af inficerede dyr og screening af indkommende dyr, bør problemet løses meget hurtigt. Importerede dyr skal vaccineres med SeV og placeres i karantæne, mens avlsprogrammer i laboratoriemiljøet bør afbrydes, og de ikke-avlsvoksne isoleres i to måneder.

Virusinduceret immunosuppression

Virussen er en stærk immunmodulator . SeV kan virke i begge retninger: det kan aktivere eller undertrykke immunresponset afhængigt af celletype, vært og tidsperiode efter infektionsstart. Viruset kan undertrykke IFN -produktions- og responsveje samt betændelsesvej .

Apoptose -hæmning

Sendai -virus P -genet koder for et indlejret sæt proteiner (C ', C, Y1 og Y2), som kollektivt kaldes C -proteiner (se afsnittet "genomstruktur" nedenfor). C -proteiner fra SeV er i stand til at undertrykke apoptose. C -proteinernes antiapoptotiske aktivitet understøtter SeV -infektion i værtscellerne.

Interferonproduktion og signaltransduktionsinhibering

Virussen forhindrer stimulering af type 1 IFN- produktion og efterfølgende celleapoptose som reaktion på virusinfektion ved at hæmme aktiveringen af IRF-3 . To virusproteiner: C og V er hovedsageligt involveret i denne proces. SeV kan dæmpe celleforsvarsmekanismer og tillade sig selv at flygte fra værtens medfødte immunitet ved at hæmme interferonresponsvejen ud over at hæmme interferonproduktionen.

Anti-IFN-aktivitet af C-protein deles på tværs af familien Paramyxoviridae og ser derfor ud til at spille en vigtig rolle i paramyxovirus immununddragelse. Human Parainfluenza Virus type 1 (HPIV1), som er en nær slægtning til SeV og (i modsætning til SeV) er et vellykket humant patogen, udtrykker ikke V -proteiner, kun C -proteiner. Så alle nødvendige funktioner fra V i SeV kan leveres af C i HPIV1. Således har C og V disse "overlappende funktioner" på grund af den mange facetter af værtsforsvar, der kan imødegås på så mange steder, og præcis hvor godt og hvor delvist vil forklare værtsbegrænsning.

Værtsbegrænsning og sikkerhed for husdyr

I øjeblikket er der ingen videnskabelige data opnået ved hjælp af moderne detektionsmetoder, der ville identificere SeV som et smitsomt sygdomsfremkaldende middel til mennesker eller husdyr. Moderne metoder til identifikation af patogene mikroorganismer har aldrig påvist SeV hos svin eller andre husdyr, på trods af isolering af andre paramyxovirus. Derfor er det anerkendt, at Sendai -virussygdom, der forårsager infektion, er værtbegrænsende for gnavere, og virussen forårsager ikke sygdom hos mennesker eller husdyr, som er naturlige værter for deres egne parainfluenza -vira. Efter eksperimentel SeV -infektion kan viruset replikere og kaste sig fra de øvre og nedre luftveje af afrikanske grønne aber og chimpanser, men det forårsager ikke nogen sygdom. Sendai-virus er blevet brugt og demonstreret en høj sikkerhedsprofil i kliniske forsøg med både voksne og børn for at immunisere mod human parainfluenza-virus type 1, da de to vira deler fælles antigene determinanter og udløser dannelsen af ​​krydsreaktive neutraliserende antistoffer . Undersøgelsen, der blev offentliggjort i 2011, viste, at SeV -neutraliserende antistoffer (som blev dannet på grund af human parainfluenza -virus type 1 tidligere infektion) kan påvises hos 92,5% af mennesker på verdensplan med en median EC ₅₀ -titer på 60,6 og værdier fra 5,9– 11.324. Lav baggrund for anti-SeV-antistoffer blokerer ikke SeV-basevaccinens evne til at fremme antigenspecifik T-celleimmunitet.

Historiske sikkerhedsproblemer

I 1952 forsøgte Kuroya og hans kolleger at identificere et smitsomt middel i humane vævsprøver på Tohoku University Hospital, Sendai , Japan . Prøverne blev taget fra lungen af ​​et nyfødt barn, der var ramt af dødelig lungebetændelse. Det primære isolat fra prøverne blev passeret i mus og efterfølgende i embryonerede æg. Det isolerede smitsomme middel blev senere kaldt Sendai -virus, som blev brugt i flæng med navnet "Hemagglutinating Virus of Japan". Kuroya og hans kolleger var overbeviste om, at de isolerede virussen, som er et nyt etiologisk middel til humane luftvejsinfektioner. Senere i 1954 fremsatte Fukumi og hans kolleger ved Japan National Institute of Health en alternativ forklaring på virusets oprindelse. Det blev foreslået, at de mus, der blev brugt til at passere virussen, var inficeret med museviruset. Således blev musevirus senere overført til embryonerede æg, isoleret og til sidst navngivet Sendai -virus. Denne forklaring af Fukumi, der peger på musen frem for virusets menneskelige oprindelse, er senere blevet understøttet af adskillige videnskabelige data. De historiske aspekter af Sendai -virusisolationen og kontroversen bag er godt beskrevet i anmeldelsen. Således blev det i nogen tid fejlagtigt antaget, at Sendai -virus er patogen, der forårsager sygdom hos mennesker. Den forkerte antagelse om, at virussen blev isoleret fra humant infektiøst materiale, rapporteres stadig af Encyclopædia Britannica og af ATCC i beskrivelsen af ​​det virale isolat Sendai/52's historie. Man mente også, at virussen ikke kun kunne forårsage sygdom hos mennesker, men også hos svin, fordi antistoffer mod virussen ofte blev fundet i deres organismer under svineepidemien i Japan i 1953–1956. Høj forekomst af seropositivitet over for virussen blev observeret hos svin i 15 distrikter i Japan. Der blev senere fundet en forklaring på denne udbredte påvisning af antistoffer (se afsnittet nedenfor). På trods af overvældende beviser, der tyder på, at SeV er værtbegrænsende gnaverpatogen, er der i nogle veterinære manualer [2] og sikkerhedsbroschyrer Sendai Virus Fact Sheet - Stanford Environmental Health & Safety [3] SeV stadig opført som en virus, der kan forårsage sygdom hos svin. Lignende oplysninger leveres af Encyclopædia Britannica. I virkeligheden er de multiple isolater af paramyxovirus hos grise ved hjælp af moderne nukleinsyresekventeringsmetoder aldrig blevet identificeret som SeV.

Antigent stabilitet og krydsreaktive antistoffer

Alle vira i familien Paramyxoviridae er antigenisk stabile; derfor repræsenterer de familierepræsentanter, der er nære slægtninge og tilhører samme slægt, sandsynligvis fælles antigene determinanter. Således har svin parainfluenza 1 , som har homologi med høj sekvens med SeV og også tilhører den samme slægt Respirovirus som SeV, sandsynligvis krydsreaktive antistoffer med SeV. Måske var svinen parainfluenza 1 ansvarlig for svinesygdom i Japan i 1953–1956. Den antigene krydsreaktivitet blandt disse to repræsentanter inden for slægten Respirovirus kan imidlertid forklare, hvorfor SeV-antistoffer blev fundet hos syge grise, og hvorfor man mente, at SeV var den etiologiske årsag til grisesygdomme. Human parainfluenza virus type 1, deler også almindelige antigene determinanter med SeV og udløser dannelsen af ​​krydsreaktive neutraliserende antistoffer . Denne kendsgerning kan forklare stor spredning af påvisning af SeV-antistoffer hos mennesker i 1950'erne-1960'erne. Nyligt offentliggjort undersøgelse viste også denne vidtspændingsdetektion. Undersøgelsen, der blev offentliggjort i 2011, viste, at SeV -neutraliserende antistoffer (som blev dannet på grund af human parainfluenza -virus type 1 tidligere infektion) kan påvises hos 92,5% af mennesker verden over med en median EC ₅₀ -titer på 60,6 og værdier fra 5,9– 11.324. Lav baggrund for anti-SeV-antistoffer blokerer ikke SeV-basevaccinens evne til at fremme antigenspecifik T-celleimmunitet.

Virusudslip i luftveje hos ikke-naturlige værter

Sendai-virusadministration til ikke-naturlige værter resulterer i afgivelse af virioner i luftvejene. 10 timer senere efter intranasal SeV -administration kan infektiøse virioner, der bærer fremmede transgener, påvises i fårelunger. Desuden replikerer SeV til påviselige niveauer i de øvre og nedre luftveje af afrikanske grønne aber og chimpanser.

Virus induceret antiviral immunitet

SeV kan overvinde antivirale mekanismer i nogle af dets naturlige værter (nogle gnavere), men virussen er ineffektiv til at overvinde disse mekanismer i nogle andre organismer, der er virusresistente. Både medfødt og adaptiv immunitet fremmer effektiv genopretning fra SeV -infektion. Ved hjælp af de mekanismer, der er beskrevet nedenfor, stimulerer virussen produktionen af interferoner og andre cytokiner, der giver beskyttelse mod vira.

SeV stimulerer interferonproduktion og transduktionsvej

Hovedkomponenten i medfødt antiviralt respons er produktion af type I interferoner (IFN'er) , og de fleste celler kan producere type I IFN'er , herunder IFN -α og -β. Genkendelse af cellulære molekyler, der kaldes mønstergenkendelsesreceptorer (PRR) af udløsende virale elementer, såsom virusgenomisk RNA, replikationsformidlende dobbeltstrenget RNA eller virale ribonukleoproteiner, fremmer IFN-produktion og reaktionsveje. Virale genomiske og proteinkomponenter kan binde variable PRR'er og stimulere en signalvej, der resulterer i aktivering af transkriptionsfaktorer, som flyttes til kerne og udløser type I IFN'er -transkription.

Viral stimulering af RIG-1 og MDA-5 medieret IFN-produktion

Interferon produktion

På grund af kraftfulde IFN-stimulerende egenskaber, inden rekombinant IFN blev tilgængelig til medicinsk brug, blev SeV blandt andre vira udvalgt til industriel IFN-produktion i stor skala. En procedure, der involverede inaktiveret SeV -behandling af humane perifere blodleukocytter fra donorers blod, blev anvendt til denne produktion.

Nedenfor er en tabel, der angiver kendte PRR'er og interferon -regulatoriske faktorer, der aktiveres ved SeV -infektion.

Mange forskellige celler kan producere interferon som reaktion på SeV

Interferon -responsvej beskytter celler mod SeV -infektion

SeV kan stimulere og/eller hæmme IFN-beta- responsvejen afhængigt af celletype og vært. Hvis SeV udløser IFN -produktion, beskytter det producerede IFN yderligere celler mod de næste runder af SeV -infektion. Flere eksempler på IFN-beta-beskyttende celler fra SeV er beskrevet. Forbehandling af humane lungefibroblaster MRC-5- celler med IFN-beta hæmmer replikationen af ​​SeV.

En lignende IFN-beta- beskyttelse mod virussen er blevet observeret for nogle humane maligne celler, der opretholder IFN-responsvejen. HeLa -celler kan inficeres med SeV; inkubation af disse celler med IFN-beta forårsager imidlertid inhibering af SeV-replikation. Flere interferonstimulerede gener (ISG) blev identificeret som nødvendige for denne inhibering, herunder IRF-9 , ZNFX1 , TRIM69 , NPIP , TDRD7 , PNPT1 og så videre. Et af disse gener TDRD7 blev undersøgt mere detaljeret. Det funktionelle TDRD7 -protein hæmmer replikationen af ​​SeV og andre paramyxovirus og undertrykker autofagi , som er nødvendig for produktiv infektion med disse vira.

SeV udløser også ekspression af IFN -induceret Ifit2 -protein, der er involveret i at beskytte mus mod SeV gennem endnu ukendt mekanisme. Derudover udløser SeV ekspressionen af ​​det kemokininterferon-y-inducerbare protein 10 kDa (CXCL10) , som er involveret i kemotaksi, induktion af apoptose, regulering af cellevækst og formidling af angiostatiske effekter. Human mastcelleinfektion med SeV inducerer ekspression af interferon-stimulerede gener MxA Human MxA-protein: en interferon-induceret dynaminlignende GTPase med bred antiviral aktivitet og IFIT3 ud over aktivering af ekspression af type 1 IFN , MDA-5 , RIG-1 og TLR-3 .

SeV stimulering af produktion af inflammatoriske cytokiner, infammasomer og beta-defensiner

Cytokiner

Sendai -virus kan fremkalde produktionen af ​​mange cytokiner, der forbedrer cellulære immunresponser . Nogle beviser, der viser, at SeV aktiverer transkriptionsfaktoren NF-κB, og denne aktivering hjælper med at beskytte mod SeV-infektion. SeV kan stimulere produktionen af makrofaginflammatorisk protein-1α (MIB-1α) og –β (MIB-1β) , RANTES (CCL5) , tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa) , tumornekrosefaktor-beta (TNF-beta ) , interleukin-6 (IL-6) , interleukin-8 (IL-8) , interleukin-1 alfa (IL1A) , interleukin-1 beta (IL1B) , trombocyt-afledt vækstfaktor (PDGF-AB) og små koncentrationer af interleukin-2 (IL2) og GM-CSF . Selv plasmider, der leverer det F-kodende gen af ​​SeV til tumorceller i modeldyr, udløser produktionen af RANTES (CCL5) i tumorinfiltrerede T-lymfocytter . SeV inducerer produktionen af B-celle-aktiverende faktor af monocytter og af nogle andre celler. Varmeinaktiveret SeV-virus inducerer produktion af IL-10- og IL-6-cytokiner af dendritiske celler (DC) . Mest sandsynligt er F-protein ansvarlig for denne induktion, fordi rekonstituerede liposomer indeholdende F-protein kan stimulere IL-6-produktion ved DC . Produktionen af ​​IL-6 som reaktion på SeV-infektion er begrænset til konventionelle dendritiske celler (DC'er ) undersæt, såsom CD4 ⁺ og dobbelt negativ (dnDC).

Den UV-inaktiverede SeV (og sandsynligvis også den levende virus) kan stimulere dendritiske celler til at udskille kemokiner og cytokiner, såsom interleukin-6 , interferon-beta , kemokin (CC-motiv) ligand 5 og kemokin (CXC-motiv) ligand 10 . Disse molekyler aktiverer både CD8 ⁺ T -celler såvel som naturlige dræberceller . UV-inaktiveret SeV udløser produktionen af ​​et intercellulært adhæsionsmolekyle -1 (ICAM-1, CD54) , som er et glycoprotein, der fungerer som en ligand for makrofag-1-antigen (Mac-1) og lymfocytfunktionsassocieret antigen 1 ( LFA) -1 ( integrin )). Denne inducerede produktion sker ved aktivering af NF-KB nedstrøms for mitokondrie antivirale signalveje og RIG-I . Den øgede koncentration af ICAM-1 på cellernes overflade øger disse cellers sårbarhed over for naturlige dræberceller . Det er blevet vist i Namalwa -cellerne, at SeV -virus stimulerer et udtryk for mange gener, der er involveret i immunforsvarsveje, såsom type I og type II IFN -signalering samt cytokinsignalering. Blandt de ti mest virusinducerede mRNA'er er IFNα8 , IFNα13 , IFNβ , IFNλ: (L28α , IL28β , IL29 ), OASL , CXCL10 , CXCL11 og HERC5 .

Stimulering af inflammasom hjælper med at beskytte mod SeV -infektion

Ved anvendelse af humane embryonale nyreceller ( HEK 293T ) er det blevet vist, at SeV kan stimulere produktionen af ​​en mønstergenkendelsesreceptor NLRC5 , som er et cytosolisk protein, der hovedsageligt udtrykkes i hæmatopoietiske celler . Denne produktion aktiverer cryopyrin (NALP3) inflammasomet . Anvendelse af human monocytisk cellelinie -1 (THP-1) er det blevet vist, at SeV kan aktivere signal transduktion af mitokondrie antivirale signalering protein signalering (Mavs) , som er en mitokondrier-associerede adaptor-molekyle, som er nødvendig for optimal NALP3 - inflammasome aktivitet . Gennem MAVS-signalering stimulerer SeV oligomeriseringen af NALP3 og udløser NALP3-afhængig aktivering af caspase-1, der igen stimulerer caspase 1-afhængig produktion af interleukin -1 beta (IL-1β) .

Stimulering af beta-defensin produktion

SeV er en meget effektiv stimulans til ekspression af human beta-defensin-1 (hBD-1) . Dette protein er medlem af beta-defensin-familien af ​​proteiner, der bygger bro mellem medfødte og adaptive immunresponser til en patogen infektion. Som reaktion på SeV-infektion øges produktionen af ​​hBD-1 mRNA og protein 2 timer efter eksponering for virussen i rensede plasmacytoid dendritiske celler eller i PBMC.

Langsigtet antiviral immunitet

Efter virusinfektion hos gnavere fremmer type I IFN'er SeV -clearance og fremskynder migration og modning af dendritiske celler. Dog kort efter virusinfektion genererer dyr effektivt cytotoksiske T -celler uafhængigt af type I IFN -signalering og rydder virussen fra deres lunger. Desuden udvikler selv de dyr, der ikke reagerer på type I IFN, langsigtet anti-SeV-immunitet i en form for hukommelsesrespons, der omfatter dannelse af CD8 ⁺ T-celler og neutraliserende antistoffer. Denne hukommelsesreaktion kan beskytte dyr mod yderligere udfordringer med en dødelig dosis virus.

Som et onkolytisk middel

Sendai-virusbaseret kræftbehandling for model- og ledsagende dyr er blevet rapporteret i flere videnskabelige artikler. De beskrevne undersøgelser viser, at Sendai -virus har potentiale til at blive et sikkert og effektivt terapeutisk middel mod en lang række menneskelige kræftformer. Høj genomisk stabilitet af SeV er en meget ønskelig egenskab for oncolytiske vira. SeV vil sandsynligvis ikke udvikle sig til en patogen stamme eller til en virus med nedsat onkolytisk potentiale. Den cytoplasmatiske replikation af virussen resulterer i mangel på integration af værtsgenomet og rekombination, hvilket gør SeV sikrere og mere attraktiv kandidat til bredt anvendt terapeutisk onkolyse sammenlignet med nogle DNA -vira eller retrovira.

Sikkerhed for mennesker

En af de store fordele ved Sendai -virussen som et potentielt onkolytisk middel er dens sikkerhed. Selvom virussen er udbredt i gnaverkolonier og har været brugt i laboratorieforskning i årtier, er det aldrig blevet observeret, at det kan forårsage menneskelig sygdom. Desuden er Sendai-virus blevet brugt i kliniske forsøg med både voksne og børn til at immunisere mod human parainfluenza-virus type 1, da de to vira deler fælles antigene determinanter og udløser dannelsen af ​​krydsreaktive neutraliserende antistoffer . Sendai-virusadministrationen i formen af næsedråber i doser fra 5 × 10 ⁵ 50% embryo infektiøs dosis (EID50) til 5 × 10 ⁷ EID50 inducerede produktionen af ​​neutraliserende antistoffer mod det humane virus uden målbare bivirkninger. Resultaterne af disse forsøg repræsenterer yderligere tegn på Sendai-virussikkerhed for mennesker. Udviklingen af ​​T-cellebaserede AIDS-vacciner ved hjælp af Sendai-virusvektorer nåede fase II-kliniske forsøg. Evaluering af sikkerheden og immunogeniciteten af ​​en intranasalt administreret replikationskompetent Sendai-virusvektoriseret HIV Type 1 gagvaccine viste: induktion af potente T-celle- og antistofresponser i prime-boost-regimer. Sendai -virus bruges også som rygrad til vaccine mod respiratorisk syncytial virus (RSV).

Model kræft

For kræftstudier er det ønskeligt, at den onkolytiske virus er ikke-patogen for forsøgsdyr, men Sendai-virus kan forårsage gnaversygdom, hvilket er et problem for forskningsstrategier. To tilgange er blevet brugt til at overvinde dette problem og gøre Sendai-virus ikke-patogen for mus og rotter. En af disse fremgangsmåder omfattede oprettelsen af ​​et sæt genetisk modificerede svækkede virale stammer. Repræsentanter for dette sæt blev testet på modeldyr, der bar en lang række transplanterbare humane tumorer. Det har vist sig, at de kan forårsage undertrykkelse eller endda udryddelse af fibrosarkom , neuroblastom , hepatocellulært karcinom , melanom , pladecelle og prostatacarcinomer. SeV -konstruktion undertrykker mikrometastase af pladecellecarcinom i hoved og hals i en orthotopisk nøgen musemodel. Der er også observeret fuldstændig udryddelse af etablerede gliosarcomer hos immunkompetente rotter. SeV-konstruktioner er også blevet skabt med et modificeret proteasespaltningssted i F-proteinet. Modifikationen tillod den rekombinante virus specifikt at inficere kræftceller, der udtrykte de tilsvarende proteaser.

Figur 1. Hunde mastcelletumorer behandlet med oncolytisk Sendai -virus. Sag 1. Hannhund på 7 år udviklede kutan, sårdannet og dårligt differentieret mastocytom (35 mm diameter) placeret tæt på hans anus. (1) primær tumor; (2) 2 uger efter den første virusbehandling; (3) 4 uger efter den første virusbehandling. Case 2. Mandlig tysk korthåret pointer på 9 år gammel udviklet subkutant, regionalt (trin 2) mellemdifferentieret mastocytom. Den primære tumor blev fjernet uden rene margener. (1) sekundær vækst 1 uge efter den kirurgiske procedure; (2) 2 uger efter den første virusbehandling; (3) 5 uger efter den første virusbehandling.

En anden tilgang til at gøre Sendai-virus ikke-patogen omfattede kortvarig behandling af virionerne med ultraviolet lys . En sådan behandling medfører tab af virusreplikationsevnen. Selv denne replikations-mangelfulde virus kan imidlertid forårsage kræftcellernes død og stimulere antitumorimmunitet. Det kan udløse omfattende apoptose af humane glioblastomceller i kultur, og det kan effektivt undertrykke væksten af ​​disse celler i modeldyr. Den ultraviolet lysbehandlede virus kan også dræbe humane prostatacancerceller i kultur ved at udløse deres apoptose og udrydde tumorer, der stammer fra disse celler i immundefekt modeldyr. Desuden kan det stimulere immunmoduleret tumorregression af tyktarm og nyrekræft i immunkompetente mus. Lignende regressioner forårsaget af replikationsmangel Sendai-virus er blevet observeret hos dyr med transplanterede melanomtumorer .

Naturlige kræftformer

Nogle kræftundersøgelser med ikke-gnaverdyr er blevet udført med den umodificerede Sendai-virus. Efter intratumorale injektioner af virussen blev der således observeret fuldstændig eller delvis remission af mastcelletumorer ( mastocytomer ) hos hunde, der var ramt af denne sygdom. Kortsigtet remission efter en intravenøs injektion af SeV blev beskrevet hos en patient med akut leukæmi, der blev behandlet i Clinical Research Center på University Hospitaler i Cleveland (USA) af flere vira i 1964. Det rapporteres også, at Moskvastammen af ​​SeV blev testet af Dr. V. Senin og hans team som et lægemiddel mod kræft i et par dusin patienter ramt af forskellige maligniteter med metastatisk vækst i Rusland i 1990'erne. Viruset blev injiceret intradermalt eller intratumoralt, og det forårsagede feber hos mindre end halvdelen af ​​de behandlede patienter, som normalt forsvandt inden for 24 timer. Lejlighedsvis forårsagede virusadministrationen betændelse i den primære tumor og metastaser. Kliniske resultater var varierende. En lille del af de behandlede patienter oplevede udtalt langvarig remission med forsvinden af ​​primære tumorer og metastaser. Nogle gange var remissionen 5-10 år eller mere efter viroterapi. Kort beskrivelse af patientjournaler for patienter, der oplever langvarig remission, er præsenteret i patentet. Intratumoral injektion af UV -bestrålet og inaktiveret SeV resulterede i en antitumor -effekt hos nogle få melanompatienter med progressiv IIIC eller IV progressiv sygdom med hud- eller lymfemetastase. Hele eller delvise reaktioner blev observeret i cirka halvdelen af ​​de injicerede og ikke -injicerede mållæsioner.

Anticancer -mekanisme

Direkte kræftceller dræber. Maligne celler er sårbare over for SeV -infektion.

Sendai -virus kan inficere og dræbe variable kræftceller (se afsnittet Følsomme cellelinjer og virusstammer ). Nogle maligne celler er imidlertid resistente over for SeV -infektion. Der er flere forklaringer på sådan modstand. Ikke alle kræftceller har celleindgangsreceptorer for virussen, og ikke alle kræftceller udtrykker virusbehandling serinproteaser. Der er også andre mekanismer, der kan gøre en kræftcelle resistent over for en oncolytisk virus. For eksempel opretholder nogle kræftceller interferonresponssystem, der helt eller delvist beskytter en værtsceller mod en virusinfektion. Derfor skulle biomarkører udvikles for at identificere tumorer, der kan bukke under for SeV -medieret onkolyse.

Sendai virus celleindgangsreceptorer er ofte overudtrykt i kræftceller.

SeV -receptorer er potentielle biomarkører til vurdering af sårbarheden af ​​ondartede celler over for virussen. De repræsenteres af glykoproteiner og glycolipider (se afsnittet " SeV -celleindgangsreceptorer "). Udtrykket af nogle molekyler, der kan lette indtrængen af ​​SeV -celle (se afsnittet " SeV -celleindgangsreceptorer "), fremskynder ofte karcinogenese og/eller metastaseudvikling . For eksempel korrelerer tilstedeværelsen af Sialyl-Lewis ^x- antigen (klynge af differentiering 15s (CD15s)) , som er en af ​​SeV- celleadgangsreceptorer , på den ydre cellemembran med invasionspotentiale for maligne celler, tumorrecidiv og samlet patient overlevelse for en ekstremt bred vifte af kræftformer. Derfor kan SeV -virus fortrinsvis trænge ind i sådanne celler. Ekspression af Vim2 -antigenet , som er en anden SeV -celleadgangsreceptor , er meget vigtig for den ekstravaskulære infiltreringsproces af akutte myeloide leukæmiceller . GD1a , gangliosid fungerer også som SeV -receptor og findes i store mængder på overflader af brystkræftstamceller . Høj celleoverfladeekspression af en anden SeV -receptor - gangliosid sialosylparaglobosid / SPG / NeuAcα2-3PG. karakteriserer lymfoide leukæmiceller . Blandt andre receptorer repræsenteret af gangliosider udtrykkes GT1b stærkt på de ydre membraner i hjernemetastaseceller , der stammer fra et ekstremt bredt område af kræft, mens GD1a, GT1b og GQ1b kan påvises i humane gliosarkomer. Imidlertid overstiger deres mængde ikke mængden i normal frontal cerebral cortex. De asialoglycoprotein receptorerne , der binder Sendai-virus. og fungerer som SeV -celleadgangsreceptorer udtrykkes stærkt i levercancer .

Cellulær ekspression af glycoproteiner kan evalueres ved hjælp af forskellige molekylærbiologiske metoder, som omfatter RNA- og proteinmålinger. Imidlertid kan cellulær ekspression af gangliosider , som er sialinsyreholdige glycosphingolipider , ikke evalueres ved disse metoder. I stedet kan det måles ved hjælp af anti-glycan-antistoffer, og på trods af den store samling af sådanne antistoffer i en fællesskabsressourcedatabase er de ikke altid tilgængelige for hvert gangliosid. Derfor er indirekte måling af gangliosidekspression ved at kvantificere niveauerne af fucosyltransferaser og glycosyltransferaser, der fuldender glycansyntese, et alternativ. Der er tegn på, at ekspression af disse enzymer og produktion af gangliosider stærkt korrelerer. Mindst fire repræsentanter for fucosyltransferaser og flere glycosyltransferaser inklusive sialyltransferaser er ansvarlige for syntesen af gangliosider, der kan tjene som SeV -receptorer. Alle disse proteiner er ofte overudtrykte i forskellige tumorer, og deres ekspressionsniveauer korrelerer med tumorens metastatiske status og patienternes kortere levetid. Disse enzymer er således også potentielle biomarkører for SeV-oncolytisk infektivitet

Sendai -virus proteolytiske behandlingsenzymer er ofte overudtrykt i kræftceller.

Fusionsproteinet (F) i SeV syntetiseres som en inaktiv forløber og aktiveres ved proteolytisk spaltning af værtscellens serinproteaser (se afsnittet "Proteolytisk spaltning ved hjælp af cellulære proteaser" nedenfor). Nogle af disse proteaser er overudtrykt i maligne neoplasmer. For eksempel er transmembran serinprotease 2 ( TMPRSS2 ), som er et F-protein-behandlingsenzym, ofte overudtrykt i prostatacancerceller . Det er også overudtrykt i nogle cellelinjer, der stammer fra forskellige maligne neoplasmer. Således udtrykkes det stærkt i blærekarcinom , humant tyktarmscancer CaCo2 og brystkarcinomer SK-BR-3 , MCF7 og T-47d . En anden F-protein-protease er tryptase beta 2 ( TPSB2 ). Denne protease (med alias som tryptase-Clara og mastcelletryptase) udtrykkes i normale klubceller og mastceller og i nogle kræftformer. Det er særligt højt udtryk observeret i den humane mastcellelinje HMC-1 og i den humane erythroleukæmicellelinje HEL. Plasminogen ( PLG ), hvorfra mini-plasminen stammer, der kan spalte F-proteinet, kommer stærkt til udtryk i leverkræft. Dens udtryk øges også i en lang række andre maligne neoplasmer. Faktor X (F10) udtrykkes ofte i normal lever og i leverkræft. SeV -konstruktioner blev skabt med et modificeret proteasespaltningssted. Modifikationen tillod den rekombinante virus specifikt at inficere kræftceller, der udtrykte de tilsvarende proteaser, som kan spalte et modificeret proteasespaltningssted.

Defekter i interferonsystemet

Interferonproduktions- og / eller responssystemet fungerer ofte i funktionsfejl i maligne celler; derfor er de meget mere sårbare over for infektion med oncolytiske vira sammenlignet med normale celler. Således bevarer celler tilhørende tre humane cellelinjer, der stammer fra variable maligniteter, såsom U937 , Namalwa og A549 , deres evne til at blive inficeret med SeV selv efter behandling med type 1 IFN. Interferonresponssystem er brudt i disse celler, og det kan ikke beskytte dem mod SeV -infektion.

I Namalwa -celler stimulerer SeV -virus et udtryk for mange gener, der er involveret i immunforsvarsveje, såsom type I og type II IFN -signalering samt cytokinsignalering. Blandt de ti mest virusinducerede mRNA'er er IFNα8 , IFNα13 , IFNβ , IFNλ: (L28α , IL28β , IL29 ), OASL , CXCL10 , CXCL11 og HERC5 . På trods af stimulering af disse geners ekspression med SeV kan Namalwa -celler imidlertid ikke beskytte sig mod virusinfektionen.

Sendai -virusens evne til at hæmme interferonrespons i nogle kræftceller

I HeLa-celler kan SeV (i modsætning til Vesicular Stomatitis Virus) modvirke IFN-α-forbehandling og holde et viralt protein-oversættelsesniveau svarende til det i IFN-ubehandlede celler.

Aktivering af en nekroptotisk vej i maligne celler

Det er blevet vist ved hjælp af fibrosarcoma cellelinje L929, at SeV er i stand til at fremkalde malign celledød gennem nekroptose . Denne type celledød er yderst immunogen, fordi døende nekroptotiske celler frigiver molekylære molekylære mønstre ( DAMP'er ), der initierer adaptiv immunitet . Den nekroptotiske vej, udløst af SeV, kræver RIG-I- aktivering og tilstedeværelsen af ​​SeV-kodede proteiner Y1 og/eller Y2.

Virus, medieret fusion af kræftceller, dræber dem hurtigere

Værtsorganismen bekæmper virusinfektion ved hjælp af forskellige strategier. En sådan strategi er produktionen af neutraliserende antistoffer . Som reaktion på denne produktion har vira udviklet deres egne strategier til spredning af infektionen og undgå inaktivering af værten producerede neutraliserende antistoffer. Nogle vira, og især paramyxovirus, kan producere nye viruspartikler ved at fusionere inficerede og sunde værtsceller. Denne fusion fører til dannelsen af ​​en stor multi-nuklear struktur ( syncytium ). Sendai -virus, som repræsentant for Paramyxoviridae , bruger denne strategi til at sprede sin infektion (se afsnittet "Directed cell fusion" nedenfor). Viruset kan smelte op til 50-100 celler ved siden af ​​en primær inficeret celle. Denne multi-nukleare formation, der stammer fra flere snesevis af celler, overlever i flere dage og frigiver efterfølgende funktionelle virale partikler.

Det er blevet påvist, at en viruss evne til at ødelægge tumorceller stiger sammen med en stigning i virusets evne til at danne store multi-nukleare strukturer. Overførsel af gener, der er ansvarlige for dannelsen af ​​syncytium fra repræsentanten for Paramyxoviridae til repræsentanterne for Rhabdoviridae eller Herpesviridae gør modtagerviraerne mere onkolytiske . Endvidere kan onkolytisk potentiale paramyxovirus forøges ved mutationer i fusions- (F) gen protease -cleavage site, som giver F-proteinet, der skal mere effektivt behandles af cellulære proteaser. Indførelsen af ​​F -genet for SeV i form af et plasmid i tumorvævet i mus ved elektroporation viste, at ekspressionen af ​​F -genet øger T -celleinfiltrationen af ​​tumoren med CD4 + og CD8 + celler og hæmmer tumorvækst. Det blev også vist i andre lignende forsøg, at kræftceller selv, transficeret med plasmider, der koder for viral membranglycoproteiner med fusionsfunktion, forårsager den kollektive død af naboceller, der danner syncytium med dem. Rekruttering af tilskuerceller til syncytium fører til betydelig regression af tumoren.

Dræbning af maligne celler ved virus udløste antitumorimmunitet

Viruset udløser indirekte immunmoduleret død af maligne celler ved hjælp af en række mekanismer, som er beskrevet i en offentliggjort anmeldelse. Det virale enzym neuraminidase (NA) , der har sialidaseaktivitet , kan gøre kræftceller mere synlige for immunsystemet ved at fjerne sialinsyrerester fra overfladen af ​​maligne celler. SeV aktiverer naturlige dræberceller (NK) , cytotoksiske T -lymfocytter (CTL) og dendritiske celler (DC) . Udskillelsen af interleukin-6 , der udløses af virussen, hæmmer også regulatoriske T-celler .

Stimulering af udskillelse af cytokiner

Intrinsiske antitumor- og antiangiogene funktioner af type I-interferoner.

Interferoner

Type I og type II interferoner har anticanceraktivitet (se afsnittet "Funktion" i artiklen " Interferon "). Interferoner kan fremme ekspression af større histokompatibilitetskompleksmolekyler , MHC I og MHC II , og stimulere immunoproteasomaktivitet . Alle interferoner øger præsentationen af ​​MHC I -afhængige antigener drastisk. Interferon gamma (IFN-gamma) fremmer også stærkt den MHC II-afhængige præsentation af antigener. Højere MHC I -ekspression fører til højere præsentation af virale og unormale peptider fra kræftceller til cytotoksiske T -celler , mens immunoproteasomet mere effektivt behandler disse peptider til indlæsning på MHC I -molekylet. Derfor øges anerkendelsen og aflivningen af ​​inficerede eller ondartede celler. Højere MHC II -ekspression forbedrer præsentationen af ​​virale og cancerpeptider til hjælper -T -celler ; som frigiver cytokiner (såsom flere interferoner, interleukiner og andre cytokiner), der stimulerer og koordinerer aktiviteten af ​​andre immunceller.

Ved nedregulering af angiogene stimuli produceret af tumorceller kan interferon også undertrykke angiogenese Derudover undertrykker de spredning af endotelceller . Sådan undertrykkelse forårsager et fald i tumor vaskularisering og efterfølgende vækstinhibering. Interferoner kan direkte aktivere immunceller, herunder makrofager og naturlige dræberceller . INF-1 og interferon gamma ( IFN-γ ) produktion udløses af SeV molekylære komponenter i mange celler (se afsnittet "Virusinduceret antiviral immunitet" ovenfor). Det er blevet påvist, at SeV også kan inducere produktionen af ​​IFN type III (IFN-lambda) af humane plasmacytoid dendritiske celler .

Ikke -interferoner

Sendai -virus kan fremkalde produktionen af ​​mange cytokiner, der forbedrer cellulære immunresponser mod kræftceller. SeV stimulerer produktionen af makrofaginflammatorisk protein-1α (MIB-1α) og –β (MIB-1β) , RANTES (CCL5) , tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa) , tumornekrosefaktor-beta (TNF-beta) , interleukin-6 (IL-6) , interleukin-8 (IL-8) , interleukin-1 alfa (IL1A) , interleukin-1 beta (IL1B) , trombocyt-afledt vækstfaktor (PDGF-AB) og små koncentrationer af interleukin -2 (IL2) og GM-CSF . Selv plasmider, der leverer det F-kodende gen af ​​SeV til tumorceller i modeldyr, udløser produktionen af RANTES (CCL5) i tumorinfiltrerede T-lymfocytter .

SeV inducerer produktionen af B-celle-aktiverende faktor af monocytter og af nogle andre celler.

Varmeinaktiveret SeV-virus inducerer produktion af IL-10- og IL-6-cytokiner af dendritiske celler (DC) . Mest sandsynligt er F-protein ansvarlig for denne induktion, fordi rekonstituerede liposomer indeholdende F-protein kan stimulere IL-6-produktion ved DC . Produktionen af ​​IL-6 som reaktion på SeV-infektion er begrænset til konventionelle dendritiske celler (DC'er ) undersæt, såsom CD4 ⁺ og dobbelt negativ (dnDC).

Den UV-inaktiverede SeV (og sandsynligvis også den levende virus) kan stimulere dendritiske celler til at udskille kemokiner og cytokiner, såsom interleukin-6 , interferon-beta , kemokin (CC-motiv) ligand 5 og kemokin (CXC-motiv) ligand 10 . Disse molekyler aktiverer både CD8 ⁺ T -celler såvel som naturlige dræberceller og tiltrækker dem til tumoren. Det er blevet vist, at i kræftcellelinjer udløser UV-inaktiveret SeV produktionen af ​​et intercellulært adhæsionsmolekyle -1 (ICAM-1, CD54) , som er et glycoprotein, der fungerer som en ligand for makrofag-1-antigen (Mac-1 ) og lymfocytfunktionsassocieret antigen 1 ( LFA-1 ( integrin )). Mac-1 og LFA-1 er receptorer fundet på leukocytter . Dette induceret produktion sker gennem aktivering af nuklear faktor-KB nedstrøms for den mitokondriske antivirale signalvejen og retinsyre-inducerbart gen I . Den øgede koncentration af ICAM-1 på overfladen af ​​kræftceller, som udløses af SeV, øger disse cellers sårbarhed over for naturlige dræberceller .

Neuraminidase (NA) fjernelse af sialinsyre fra overfladen af ​​maligne celler stimulerer naturlige dræberceller og cytotoksiske T -lymfocytter

Forhøjede niveauer af cellemembran sialylering er forbundet med øget kræftcellepotentiale for invasion og metastase og med progression af maligniteten. Nogle sialyleringshæmmere kan gøre kræftceller mindre ondartede.

En mulig forklaring på forholdet mellem øget sialylering og en malign fænotype er, at sialylering resulterer i et tykt lag belægning på cellemembranen, der maskerer kræftantigener og beskytter maligne celler mod immunovervågning. NK -cellers aktivitet og cytotoksicitet hæmmes af ekspressionen af sialinsyrer på tumorcelleoverfladen. Fjernelse af sialinsyrerester fra overfladen af ​​tumorceller gør dem tilgængelige for NK -celler og cytotoksiske T -lymfocytter og reducerer derfor deres vækstpotentiale. Desuden forbedrer behandling af tumorceller med sialidase aktiveringen af ​​NK-cellesekretion af IFN-y .

Nogle paramyxovirus, herunder SeV koder og syntetiserer neuraminidase ( sialidase ), som kan fjerne sialinsyrerester fra overfladen af ​​maligne celler. Hemagglutinin-neuraminidase (HN) er et enkelt protein, der inducerer hæmagglutination og besidder neuraminidase ( sialidase ) aktivitet. Neuraminidase (NA) , en underenhed af HN -proteinet, binder til og spalter sialinsyre fra celleoverfladen. NA fremmer også cellefusion, som hjælper de spirende virioner med at undgå kontakt med værtsantistoffer og dermed gør det muligt for virussen at sprede sig inden for væv.

Sialidase -behandling af celler forårsager tab af sialinsyrerester . Dette tab øger signifikant maligne cellers evne til at aktivere cytotoksiske T -lymfocytter . Variable sialidaser kan forårsage denne effekt, herunder NA fra Newcastle disease-virus, der har vist sig at spalte 2,3-, 2,6- og 2,8-forbindelser mellem sialinsyrerester. In vitro var der ingen signifikant forskel mellem NA'er fra Newcastle disease -virus , SeV og fåresyge -virus med hensyn til substratspecificitet . Disse resultater tyder på, at behandling af en tumor med viruset resulterer i desialylering af maligne celler, hvilket bidrager til øget anti-tumor immunovervågning. Derfor er SeV sialidases (NA) evne til at fjerne sialinsyre fra overfladen af ​​maligne celler med stor sandsynlighed med til at sikre tilgængeligheden af ​​tumorantigener til genkendelse af cytotoksiske T -lymfocytter .

Stimulering af naturlige dræberceller (NK)

Eksperimenter med UV-inaktiveret SeV viste, at NK-celler er vigtige i virusmedieret hæmning af tumorvækst. Dette blev vist i en musemodel af nyrekræft, hvor antitumoreffekten af ​​SeV blev undertrykt ved at reducere antallet af NK-celler ved co-injektion af specifikke antistoffer.

Aktiveringen af ​​NK kræver flere receptorer, heriblandt naturlige dræberproteiner 46 (NKp46) og 44 (NKp44) . Undersøgelser har vist, at det eneste paramyxovirusprotein, der aktiverer NK, er HN . HN -proteinbinding til NKp46 og/eller NKp44 resulterer i lysering af celler, hvis overflader viser HN -proteinet eller dets fragmenter. Det kan antages, at NK-aktivering og tumorsuppression af UV-behandlet SeV er forårsaget af interaktion mellem HN, der tilhører SeV, og NKp46- og/eller NKp44-receptorer, der tilhører NK-celler.

Induktion af antitumor-cytotoksicitet af cytotoksiske T-celler

SeV, selv efter UV-inaktivering, kan injiceres intratumoralt, forårsage tumorinfiltration af dendritiske celler (DC'er) og CD4+ og CD8+ T , og det kan også forårsage øget anti-tumoraktivitet af disse celler. Mest sandsynligt bidrager viralt hæmagglutinin-neuraminidase- protein i høj grad til effekten (se " Neuraminidase (NA) fjernelse af sialinsyre fra overfladen af ​​maligne celler stimulerer naturlige dræberceller og cytotoksiske T-lymfocytter " afsnit ovenfor ). Denne hypotese er baseret på to observationer. For det første har det funktionelle hæmagglutinin-neuraminidase- protein fra det oncolytiske Newcastle disease-virus (NDV), som er en slægtning til SeV, vist sig at forstærke det tumorspecifikke cytotoksiske respons af CD8+ T-celler og øge aktiviteten af CD4+ T- hjælperceller . For det andet fremmer UV-inaktiveret NDV , som ikke kan replikeres, fremmer anti-tumor CTL-respons såvel som intakt NDV , som kan replikere. Da hæmagglutinin-neuraminidase- proteiner i SeV- og NDV-vira er stærkt homologe, er det sandsynligt, at HN- proteinet i SeV-viruset kan aktivere både CTL- og naturlige dræbercelleresponser . Mest sandsynligt neuraminidase fjernelse af sialinsyre fra overfladen af ​​maligne celler bidrager til denne effekt.

SeV -stimulering af dendritiske celler

UV-inaktiveret SeV kan få dendritiske celler (DC'er) til at modnes og infiltrere en tumor, og ex vivo- infektion af DC'er med rekombinant SeV inducerer modning og aktivering af DC'er inden for 60 minutter. Når aktive DC'er, der bærer varianter af rekombinant SeV, administreres, forbedres overlevelsen af ​​dyr injiceret med malignt melanom, kolorektal cancer, pladecellecarcinom, levercancer, neuroblastom og prostatakræft betydeligt. Det er blevet vist, at administrationen af ​​sådanne DC'er før tumorcelleinjektion forhindrer metastase af neuroblastom og prostata adenocarcinom til lungerne.

SeV kan replikere til høje titere i humane monocyt-afledte DC'er. Med infektionsmængden på 2 begynder ca. 1/3 af DC'erne at udtrykke kodede SeV -proteiner 8 timer efter infektion. Denne andel stiger til 2/3, 24 timer og falder til 1/3, 48 timer efter infektion. SeV demonstrerer høj cytopatisk virkning på DC'er; virussen kan dræbe en tredjedel af DC selv med en meget lav infektionsmængde, f.eks. 0,5. Den vigtigste observation er, at SeV -infektion udløser DC -modning, hvilket manifesteres i DC -celleoverflademarkørers sammensætning. Viruset øger ekspressionen af ​​klasse I- og klasse II-molekyler i det store histokompatibilitetskompleks (MHC) ( HLA-A , HLA-B , HLA-C og HLADR ), CD83 samt costimulatoriske molekyler CD40 og CD86 .

SeV -undertrykkelse af regulatoriske T -celler

Eksperimenter med dyremodeller har vist, at selv efter UV-inaktivering kan SeV blokere T-celle-medieret regulatorisk immunosuppression i tumorer. Blokeringsmekanismen er forbundet med stimulering af SeV-inaktiverede virioner af interleukin 6 (IL-6) sekretion af modne DC'er. Disse effekter fører til udryddelse af de fleste modeltumorer og hæmmer væksten af ​​resten. Det er blevet vist, at F-protein alene kan udløse IL-6-produktion i DC på en fusionsuafhængig måde.

Som en vektor

Intratumoral og intra-organ spredning af rekombinante SeV virioner in vivo i en hepatom xenograft murin model.

Visualisering af Sendai -virusinfektion hos levende dyr

Ikke -invasiv SeV -billeddannelse af variable konstruktioner

SeV har været kendt for forskningsmiljøet mere siden slutningen af ​​1950'erne, og det har været meget udbredt til at skabe flere varianter af gentekniske konstruktioner, herunder vektorer til transgener. Oprettelse af SeV -genetiske konstruktioner er lettere i forhold til andre vira, mange SeV -gener har transskriptionelle initierings- og afslutningssignaler. Derfor er konstruktion af en rekombinant virus ligetil; det fremmede gen kan introduceres i det virale genom ved at erstatte eller tilføje virale proteinudtrykkende gen (er). SeV kan omfatte et fremmed gen eller endda flere gener af stor størrelse. Det er blevet påvist, at et gen på mere end 3 kb kan indsættes og udtrykkes i SeV. På grund af udelukkende cytoplasmatisk replikation bærer viruset ikke risikoen for genetisk integration i værtsgenomerne, hvilket er et problem for mange andre virale vektorer. Genomet for SeV som genomer for andre ikke-segmenterede negativstrengede RNA-vira har en lav homolog rekombination og udvikler sig forholdsvis langsomt. Der findes flere årsager til denne genomiske stabilitet: (1) genomet er ikke -segmenteret, kan derfor ikke undergå genetisk assortiment, (2) hvert protein og hver aminosyre har en vigtig funktion. Derfor vil enhver ny genetisk indsættelse, substitution eller sletning føre til et fald eller totalt tab af funktion, der igen ville få den nye virusvariant til at være mindre levedygtig. (3) Sendai -virus tilhører en kategori af vira, der er underlagt "seks -reglen". SeV -genom som genomer for andre paramyxovirus omfatter hovedsageligt seks gener, som koder for seks hovedproteiner. Lav homolog RNA -rekombination i paramyxovirus skyldes sandsynligvis dette usædvanlige genomiske krav til polyhexamer længde (6n+0). Naturlig høj genomisk stabilitet af SeV er en positiv egenskab ved den potentielle anvendelse som en vaccinvektor eller som et onkolytisk middel. For enhver klinisk eller industriel anvendelse er det vigtigt, at SeV genomiske og indsatte fremmede gener vil blive udtrykt på en stabil måde. På grund af SeV genetisk stabilitet er flere serielle passager af viruskonstruktionen i cellekulturer eller embryonerede hønseæg mulig uden drastiske genomiske ændringer.

Omvendt genetisk system

Det omvendte genetiske system til redning af Sendai -virus blev oprettet og udgivet i 1995. Siden blev en række ændringer og forbedringer beskrevet for repræsentanter for Mononegavirales, Paramyxoviridae generelt og for Sendai -virus i særdeleshed. Hele længden af ​​vektoren SeV-genom, inklusive transgener, skal arrangeres i multipler af seks nukleotider (den såkaldte "seksregel").

Gener, tilføjelse, sletning og ændring

Rekombinante SeV -varianter er blevet konstrueret ved at indføre nye gener og/eller ved at slette nogle virale gener, såsom F, M og HN fra SeV -genomet, SeV -konstruktioner er også blevet skabt med et modificeret proteasespaltningssite i fusionsprotein (F). SeV F-proteinet er et type I- membranglykoprotein , der syntetiseres som en inaktiv forløber (F ₀ ), der skal aktiveres ved proteolytisk spaltning ved rest arginin-116. Efter spaltning F ₀ precursor-udbytter to disulfidbundne underenheder F ₁ og F ₂ . Det proteolytiske spaltningssted kan ændres, så andre værtsproteaser ville være i stand til at behandle F ₀ .

Sendai virusbaseret vektorsystem, der kan levere CRISPR/Cas9 til effektiv genredigering, blev oprettet.

Ikke-invasiv billeddannelse

Et sæt forskellige rekombinante SeV-konstruktioner, der bærer reportergener, blev skabt til ikke-invasiv billeddannelse af virusinfektionen hos dyr. Konstruktionerne gør det muligt at studere dynamikken i SeV -spredning og clearance. Nogle konstruktioner blev skabt for at levere et grønt fluorescerende protein (GFP) til en celle. En af dem, rSeV-GFP4, er kommercielt tilgængelig. Sendai-virus med grønt fluorescerende protein (SeV-GFP4) Nogle andre konstruktioner blev skabt til at levere rødt fluorescerende protein RFP. Desuden blev konstruktionerne skabt til at udtrykke luciferase -genet.

Omprogrammering til iPSC'er

En af de nyeste anvendelser af SeV-baserede vektorer er omprogrammering af somatiske celler til inducerede pluripotente stamceller . SeV-vektoren med en mutation, der er ansvarlig for temperaturfølsom fænotype, blev oprettet for at lette sletningen af ​​vektorgenomet i en cellelinje. Temperaturfølsomme mutanter af SeV, der koder for humane OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC gener, bruges til at inficere humane donorceller, men de resulterende iPSC'er blev transgenfrie. En mulig kilde til donorceller er hæmatopoietiske stamceller, der er afledt af menneskelig ledning, stimuleret med cytokiner. Blandt disse celler opnår SeV høj transgenekspression i CD34+ -celler -undersæt. En anden kilde - human primær PBMC , ifølge en teknisk note fra TaKaRa menneskelig primær PBMC fra donorblod, kan omprogrammeres direkte til iPSC i løbet af 21 dage. PBMC-afledte T-celler aktiveret i 5 dage med anti- CD3- antistof og IL-2 kan også bruges til formålet. Derudover kan humane fibroblaster bruges til oprettelse af iPSC. Systemet til sådan omprogrammering er kommercielt tilgængeligt fra ThermoFisher Scientific som CTS ™ CytoTune ™ -iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit, katalognummer: A34546. Den relevante video, der forklarer processen med vektoroprettelsen med titlen " Hvordan programmerer Sendai Virus celler? " Er tilgængelig online.

Luftvejsgenoverførsel

SeV -vektor er en af ​​de mest effektive vektorer til luftvejsgenoverførsel. I sine naturlige værter, ligesom mus og ikke-naturlige værter, som får, kan SeV-medieret fremmed genekspression visualiseres i lungerne. Dette udtryk er forbigående: intensivt i løbet af få dage efter den første SeV -administration, men vender tilbage til baseline, nulværdier, efter dag 14. Efter den anden administration reduceres ekspressionen af ​​transgener med 60% sammenlignet med niveauer opnået efter en første dosis.

Til oprettelse af vacciner

SeV har flere funktioner, der er vigtige i en vektor for en vellykket vaccine: virussen integreres ikke i værtsgenomet, den undergår ikke genetisk rekombination, den replikerer kun i cytoplasmaet uden DNA -mellemprodukter eller en kernefase. SeV, som alle andre repræsentanter for familien Paramyxoviridae , er genetisk stabil og udvikler sig meget langsomt. Til vaccinationsformål kunne de virusbaserede konstruktioner leveres i form af næsedråber, hvilket kan være fordelagtigt til at inducere et slimhindeimmunrespons . Denne vaccinationsform er mere immunogen end intramuskulær i betragtning af allerede eksisterende anti-SeV-antistoffer. Virusgenomet har stor lighed med human parainfluenza virus 1 (HPIV-1), og de to vira deler fælles antigene determinanter . Undersøgelsen, der blev offentliggjort i 2011, viste, at SeV -neutraliserende antistoffer (som blev dannet på grund af human parainfluenza -virus type 1 tidligere infektion) kan påvises hos 92,5% af mennesker på verdensplan med en median EC ₅₀ -titer på 60,6 og værdier fra 5,9– 11.324. Lav baggrund for anti-SeV-antistoffer blokerer ikke SeV-basevaccinens evne til at fremme antigenspecifik T-celleimmunitet.

Human parainfluenza virus 1 (HPV1)

Vildtype svækket SeV er blevet anvendt i kliniske forsøg , der involverer både voksne og børn at immunisere mod HPIV-1 .Den virus indgivelse i form af næsedråber i doser i området fra 5 x 10 ⁵ 50% embryo infektiøs dosis (EID50) til 5 × 10 ⁷ inducerede produktionen af neutraliserende antistoffer mod det humane virus uden målbare bivirkninger. Resultaterne af disse forsøg repræsenterer et bevis på sikkerhed for mennesker ved replikationskompetent Sendai -virusadministration. SeV-antistoffer, der krydsreagerer med HPIV-1-antistoffer, er til stede hos de fleste mennesker, men størstedelen af ​​mennesker har ikke høj titer af disse antistoffer. Undersøgelsen, der blev offentliggjort i 2011, viste, at SeV-neutraliserende antistoffer (som blev dannet på grund af HPIV-1 tidligere infektion) kan påvises hos 92,5% forsøgspersoner verden over med en median EC _50- titer på 60,6 og værdier fra 5,9-11,324. Lav baggrund for anti-SeV-antistoffer blokerer ikke SeV-basevaccinens evne til at fremme antigenspecifik T-celleimmunitet.

Human immundefektvirus type 1 ( HIV )

Udviklingen af ​​T-cellebaserede AIDS-vacciner ved hjælp af Sendai-virusvektorer finder sted nåede fase II kliniske forsøg. Evaluering af sikkerheden og immunogeniciteten af ​​en intranasalt administreret replikationskompetent Sendai-virusvektoriseret HIV Type 1 gagvaccine viste: induktion af kraftige T-celle- og antistofresponser i prime-boost-regimer.

Respiratorisk syncytial virus ( Human orthopneumovirus )

Sendai -virus blev også brugt som rygrad for vaccine mod respiratorisk syncytial virus (RSV). Denne virus (RSV) er en væsentlig årsag til infektioner i de nedre luftveje og hospitalsbesøg i barndommen og barndommen. Det blev vist, at administration af SeV-baseret RSV-vaccine beskytter bomuldsrotter og afrikanske grønne aber mod denne virusinfektion. Vaccineudviklingen mod RSV er i fase I klinisk forsøg.

Mycobacterium tuberculosis

SeV bruges i øjeblikket i prækliniske undersøgelser som rygradsvektor til vaccine mod tuberkulose . Slimhindevaccination med SeV -konstruktion genererer hukommelse CD8 T -celleimmunitet og fremmer beskyttelse mod Mycobacterium tuberculosis hos mus.

Som en vektor rygrad for COVID-19 vaccine

For effektiv forebyggelse af infektioner forårsaget af SARS-CoV-2 kan vaccinens evne til at stimulere slimhindeimmuniteten i de øvre luftveje, herunder næsehulen, være yderst vigtig. Sådan immunitet er i stand til at styrke den antivirale barriere i de øvre luftveje og give pålidelig beskyttelse mod COVID-19. Det er blevet påvist, at intranasalt administreret SeV kan fremkalde stærk slimhindeimmunitet . Således genererer slimhindevaccination med SeV robust produktion af IgA og IgG-antistoffer af nasalt associeret lymfoide væv og af lunger af bomuldsrotter. Disse antistoffer lettede hurtig beskyttelse mod human parainfluenza-virus type 1.

I Kina er Fudan University i samarbejde med Pharma Co. Ltd. engageret i udvikling af vaccinen til forebyggelse af COVID-19. SeV fungerer som rygradsvektor i projektet [27] . Forskere fra Fudan University har betydelig erfaring med at arbejde med SeV -vektorer; de oprettede SeV-baseret vaccine til forebyggelse af tuberkulose, som er i præklinisk test. Der er to Sendai -virusstammer i Kina, der blev beskrevet i videnskabelige publikationer. En af dem er BB1-stammen, der stammer fra Moskva-virusstammen og har mindre end 20 ikke-synomiske substitutioner sammenlignet med Moskva-stammen. Stammen BB1 blev givet til forskerne fra Institute of Viral Disease Control and Prevention, Beijing , Kina af forskere fra Ivanovsky Institute of Virology , Moskva, Rusland i 1960'erne. En anden stamme er Tianjin -stammen, isoleret i Kina i 2008. En af disse stammer blev brugt til oprettelse af replikationsmangel SeV85AB -konstruktion, der mangler fusionsprotein (F), men har indsat sekvens, der koder for immunodominant antigen af Mycobacterium tuberculosis . Sikkerheden og immunogeniciteten af ​​denne konstruktion blev testet i dyremodeller. Denne konstruktion kan let transformeres til den konstruktion, der koder for S-protein af SARS-CoV-2. I Rusland er State Research Center for Virology and Biotechnology VECTOR i udvikling af fase af vaccinen mod COVID-19 ved hjælp af Moskva-stammen Sendai-virus som en vektor rygrad.

Virusbiologi og egenskaber

Virion struktur

Skematisk fremstilling af Sendai virus virion

Virion -strukturen er godt beskrevet i en offentliggjort anmeldelse. Sendai-virus er et indhyllet virus: dets ydre lag er en lipidhylster , der indeholder glycoproteinhæmagglutinin -neurominidase ( HN ) med to enzymatiske aktiviteter ( hæmagglutinering og neuraminidase ). Hemagglutinin ( H ) fungerer som en celleadhæsionsfaktor og membranfusionsprotein. Neuraminidase ( NA ) er en sialidase, der spalter og fjerner sialinsyre fra overfladen af ​​en værtscelle. Denne spaltning fremmer fusionen af ​​den virale lipidhylster med cellens ydre membran.

I virusets lipidhylster findes også et fusionsprotein ( F ), som også er et glycoprotein, der sikrer virusindtrængen i en værtscelle efter viral adsorption . Under lipidmembranen er et matrixprotein ( M ); det danner det indre lag af virushylsteret og stabiliserer dets struktur. SeV-virionen indeholder også nucleocapsidkernen, som er sammensat af det genomiske RNA, nucleocapsid-proteinet ( NP ), phosphoproteinerne ( P ), som er en væsentlig underenhed af viralen af ​​RNA-afhængig RNA-polymerase (RDRP) og stort protein ( L ), der er en katalytisk underenhed af denne polymerase. C -protein, som er oversat fra en alternativ læseramme for det P -kodende mRNA, er også forbundet med et viralt capsid . Det er til stede i SeV -virioner ved relativt lave niveauer (40 molekyler/genom).

Genom

Struktur

Sendai virus genomstruktur . Positionerne på oversættelsesinitieringssteder for produkter fra den alternative læseramme for det P-kodende mRNA er angivet.

SeV-genomet er ikke-segmenteret, negativfølsom RNA, på ca. 15,384 n. i længden og indeholder de ikke -kodende 3' -leder- og 5' -trailerområder, der er ca. 50 nukleotider i længden. Som med andre respirovirus fra familien Paramyxoviridae fungerer de i SeV som cis-virkende elementer, der er afgørende for replikation. En 3' -ledersekvens fungerer som en transkriptionel promotor. Mellem disse ikke-kodende regioner findes seks gener, som koder for nucleocapsid (NP) proteinet, phosphoprotein (P), matrixprotein (M), fusionsprotein (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN) og stort (L) protein i denne ordre fra 3' -enden. Den RNA-afhængige RNA-polymerase af SeV består af det store protein (L) og phosphoproteinet (P). Den strukturelle gensekvens for SeV er som følger: 3'-NP-PMF-HN-L-5 ' . Intergenomiske regioner mellem disse gener er tre nukleotider lange som i andre respirovirus. Yderligere proteiner, der ofte kaldes ikke -strukturelle eller tilbehørsproteiner, kan fremstilles ud fra P -genet ved hjælp af alternative læserammer. Sendai -virus P/C mRNA indeholder fem ribosomale initieringssteder mellem positionerne 81 og 201 fra 5' -enden. Et af disse steder starter i den åbne P -læseramme, hvorimod fire andre initierer et indlejret sæt C -proteiner (C ', C, Y1, Y2). Disse C -proteiner initieres i + 1 læserammen til P på forskellige oversættelses startsteder. Sendai -virus bruger ribosom -shunting til at udtrykke Y1- og Y2 -proteiner, der starter ved henholdsvis det fjerde og femte startsted på P/C mRNA. Tre yderligere SeV -proteiner er også kodet af P/C mRNA. To af disse proteiner V og W er produkter af RNA -redigering , ved kodon 317 af mRNA - G -resterne tilsættes co -transkriptionelt ( +en G -rest for V og +to G for W). Det tredje - X -protein repræsenteres af 95 aminosyrer i C -terminalen af ​​P -proteinet og initieres uafhængigt af ribosomer. Alle disse ikke-strukturelle proteiner har flere funktioner, herunder organisering af viral RNA-syntese og hjælper viruset med at inficere gnaverceller ved at undslippe værtens medfødte immunitet (se afsnittet "Mekanismen for viral immunsuppression i naturlige værter" ovenfor). Det har også vist sig, at C-protein letter spiring af viruslignende partikler, og små mængder C-protein er forbundet med et viralt capsid .

Evolutionstabilitet

Genomerne af ikke-segmenterede negativstrengede RNA-vira (herunder paramyxovirus) har en lav homolog rekombination og udvikler sig forholdsvis langsomt. Flere årsager til denne genomiske stabilitet eksisterer sandsynligvis: (1) genomerne af disse vira er ikke -segmenterede og kan derfor ikke undergå genetisk assortiment, (2) hvert protein og hver aminosyre har en vigtig funktion. Derfor vil enhver ny genetisk indsættelse, substitution eller sletning føre til et fald eller totalt tab af funktion, der igen ville få den nye virusvariant til at være mindre levedygtig. (3) Sendai -virus tilhører vira, der er underlagt "seks -reglen". SeV -genom som genomer for andre paramyxovirus omfatter hovedsageligt seks gener, som koder for seks hovedproteiner. Lav homolog RNA -rekombination i paramyxovirus skyldes sandsynligvis dette usædvanlige genomiske krav til polyhexamer længde (6n+0). Naturlig høj genomisk stabilitet af SeV er en positiv egenskab ved den potentielle anvendelse som en vaccinvektor eller som et onkolytisk middel. For enhver klinisk eller industriel anvendelse er det vigtigt, at SeV genomiske og indsatte fremmede transgener ville blive udtrykt på en stabil måde. Genetisk stabilitet muliggør udførelse af mange serielle passager i cellekulturer eller embryonerede hønseæg uden viral genomisk ændring.

Virale proteiner

Sendai virus celleindgangsreceptorer. Navnene på receptorer med kendt høj bindingsaffinitet til virussen er markeret med stjerne. Navnene på receptorer, der er overudtrykt i nogle maligniteter, er med fed skrift og understreget.

Proteolytisk spaltning ved hjælp af cellulære proteaser

SeV F-proteinet er et type I- membranglykoprotein , der syntetiseres som en inaktiv forløber (F ₀ ), der skal aktiveres ved proteolytisk spaltning ved rest arginin-116. Efter spaltning F ₀ precursor-udbytter to disulfidbundne underenheder F ₁ og F ₂ . Paramyxovirus bruger forskellige værtscelleproteaser til at aktivere deres F-proteiner. Sendaivirusvektorer anvendelser aktiverende proteaser, som serin endopeptidaser repræsenteret ved tryptase beta-2- ( TPSB2 ), WikiGenes - Collaborative Publishing (som har aliaser såsom tryptase II, tryptase Clara, klub celler tryptase, mastceller tryptase,) trypsin 1 ( PRSS1 ), mini- plasmin ( PLG ) og transmembran serinprotease 2 ( TMPRSS2 ). Mest sandsynligt er blodkoagulationsfaktor X (F10) i stand til at spalte og aktivere SeV F ₀ . Det er muligt, at andre, endnu ikke identificerede cellulære proteaser, kan også behandle F ₀ proteinet af SeV.

SeV -celleadgangsreceptorer

Stammerne af respirovirus , avulavirus og størstedelen af rubulavirus , der har HN i deres kuverter, bruger sialinsyrer som deres celleindgangsreceptorer. SeV, som repræsentant for respirovirus, bruger molekyler indeholdende sialinsyrerester såsom glycoproteiner og glycosphingolipider ( gangliosider ). SeV kan også bruge lektiner til en celleindgang. Tre SeV -receptorer repræsenteres af molekyler, der er klynger af differentiering . Nogle SeV -receptorer er overudtrykt i kræftceller (se afsnittet anticancer -mekanisme ).

PROTEINS

GANGLIOSIDS (GLYCOSPHINGOLIPIDS)

Strukturerne for nogle af disse receptorer er tilgængelige til visualisering gennem SugarBindDB - en ressource for glycan -medierede vært -patogen -interaktioner. Andre er tilgængelige via KEGG Glycan Database, PubChem sammensat database og TOXNET database (toksikologi datanetværk) fra US National Library of Medicine.

Hypotetisk fusionsmekanisme af viral og cellemembran

Livscyklus

Fordi SeV er en negativ-streng RNA-virus, afsluttes hele livscyklussen i cytoplasmaet ved hjælp af sin egen RNA-polymerase.

Adsorption og fusion

Sendai -virus starter infektionsprocessen ved værtscelle -adsorption medieret af genkendelse af specifikke receptormolekyler . Hemagglutinin neuraminidase (HN) fungerer som et viruscellevedhæftningsprotein, der interagerer med en specifik celleindgangsreceptor. NH har sialidaseaktivitet , og det er i stand til at spalte sialinsyrerester fra celleceptoren. Denne spaltning udløser fusionsprocessen for viralhylster og cellemembran , som fremmer ved samarbejde med NH med det virale fusionsprotein (F). For at udføre fusionsfunktionen skal F -protein aktiveres proteolytisk fra dets forløber inaktiv form F ₀ . Denne aktivering kræver F ₀ spaltning af vært protease før virus adsorption (se afsnittet ”proteolytisk spaltning med cellulære proteaser”).

Sendai Virus livscyklus

Uncoating

Efter en sammensmeltning af værten membran og viruskappen , SeV ifølge et model er ” uncoating ” med diffusion af de virale kappe -proteiner i værtens plasmamembranen . Ifølge en anden model frigav virussen ikke sine kappeproteiner i værtsmembranen. Viral- og værtsmembranerne smeltes sammen, og der laves en forbindelsesstruktur. Denne forbindelsesstruktur fungerer som en transport "motorvej" for det virale ribonukleoprotein (RNP) . Således bevæger RNP sig gennem forbindelsesstrukturen for at nå cellens indre, så SeV -genetisk materiale kan komme ind i værtscellecytoplasma.

Cytoplasmatisk transkription og replikation

En gang i cytoplasma bliver SeV genomisk RNA involveret som en skabelon i to forskellige RNA-syntetiske processer udført af RNA-afhængig RNA-polymerase, som består af L- og P-proteiner: (1) transkription for at generere mRNA'er og (2) replikation for at producere et positivt sans-antigenom-RNA, der igen fungerer som en skabelon til produktion af afkom med negativ streng-afkom. RNA-afhængig RNA-polymerase fremmer dannelsen af ​​mRNA'er methylerede capstrukturer.

NP -proteinet menes at have både strukturelle og funktionelle roller Denne proteinkoncentration menes at regulere skiftet fra RNA -transkription til RNA -replikation. Det genomiske RNA fungerer som skabelonen for den virale RNA -transkription, indtil NP -proteinkoncentrationen stiger. Når NP -proteinet akkumuleres, sker overgangen fra transkriptionen til replikationen. NP -proteinet indkapsler det genomiske RNA og danner et spiralformet nukleocapsid, som er skabelonen for RNA -syntese af den virale RNA -polymerase. Proteinet er en crusial komponent i følgende komplekser NP-P (P, phosphoprotein), NP-NP, nucleocapsid-polymerase og RNA-NP. Alle disse komplekser er nødvendige for den virale RNA -replikation.

Oversættelse

To forskellige sæt proteiner oversættes fra virale mRNA'er. Det første sæt er repræsenteret af seks strukturelle proteiner, der inkluderer nucleocapsid protein (NP), phosphoprotein (P), matrix protein (M), fusionsprotein (F), neuraminidase (NA) og stort protein (L). Alle disse proteiner har variable funktioner og er inkorporeret i det virale capsid (se afsnittet "virionstruktur" ovenfor). Det andet sæt repræsenteres af syv ikke -strukturelle eller tilbehørsproteiner. Disse proteiner oversættes fra det polycistroniske mRNA af P -genet. Dette mRNA koder for otte oversættelsesprodukter, og P-protein er kun et af dem. Alternative varianter af translation repræsenteres af V, W, C, C ', Y, Y' og X proteiner. Proteinerne C ', C, Y1, Y2 er produkter af mRNA alternativ læseramme, de betegnes samlet som C-proteiner eller C-nestede proteiner, og de deler fælles C-terminal ende. X-proteinet deler også den samme C-terminale ende, og dets translation initieres også uafhængigt af ribosomer. Proteinerne V og W er produkter af cotranscriptional mRNA -redigering. Alle disse ikke-strukturelle proteiner har flere funktioner, herunder organisering af viral RNA-syntese og hjælper viruset med at inficere værtsceller ved at undslippe værtens medfødte immunitet (se afsnittet "Mekanismen for viral immunsuppression i naturlige værter" ovenfor).

Mulig model, der viser dannelsen af ​​det virale samlingskompleks.

Transport af virale proteiner til cellemembranen

Efter translation migrerer tre virale lipofile proteiner NA, F og M som forberedelse til den spirende proces til en værtscellemembran og binder den.

Syncytiumdannelse og direkte celle-til-celle infektionstransmission

To af SeV-proteiner: HA og F, efter deres binding direkte til en cellulær membran, fremmer en celle-cellefusion, hvilket fører til en stor multinuclear celledannelse (syncytium). Denne dannelse involverer fusion af inficerede celler med tilstødende målceller og forbliver en vigtig mekanisme for direkte celle-til-celle spredning af virale komponenter. Således kan en SeV -infektion i en form for genetisk materiale i delvist samlede virioner sprede sig uden eksponering for værtneutraliserende antistoffer (se afsnittet "Dirigerede cellesmeltning (syncytiumdannelse) for detaljer og referencer).

Spire

Sendai -virus, som alle andre konvolutvira, bruger værtscellulær membranlipid -dobbeltlag til viral kapsidmembrandannelse. Binding til en værtscellemembran af virale proteiner (M, HN og F) fremmer deres interaktion med RNP -kompleks, som er sammensat af det virale genomiske RNA bundet til SeV -proteiner (NP, P og L). Alle virale strukturelle komponenter, herunder virale glycoproteiner og genomisk RNP -kompleks, samles således. Efter en sådan samling spirer de infektiøse viruspartikler ud fra individuelt eller kollektivt inficerede celler (syncitia). C-protein letter spirende ved at interagere med AIP1/Alix, som er et værtprotein, der er involveret i apoptose og handel med endosomal membran. De infektiøse viruspartikler frigives sædvanligvis 24 timer efter infektion (hpi), og toptitre forekom mellem 48 og 72 hpi.

Vedvarende infektion

Sendai -virus kan etablere vedvarende infektion i sine værtsceller. Flere runder med virusunderkultur resulterer i oprettelse af nye virusvarianter med høj evne til at etablere vedvarende infektion. Disse SeV -varianter udvikler visse genotypiske ændringer. Den vedvarende infektion kan også etableres øjeblikkeligt i interferon -regulatoriske faktor 3 (IRF -3) -knockdown -celler. IRF-3 er et vigtigt proapoptotisk protein, der efter aktivering af SeV udløser apoptose. IRF -3 -knockdown -celler udtrykker viralt protein og producerer lave niveauer af infektiøse virioner. IRF-3 kontrollerer skæbnen for de SeV-inficerede celler ved at udløse apoptose og forhindre etablering af persistens; derfor tillader dens knock down vedholdenhed at forekomme. Det blev også rapporteret, at under SeV -infektionsreplikation dannes defekte virusgener (DVG) og beskytter selektivt en subpopulation af værtsceller mod døden og fremmer derfor etablering af vedvarende infektioner. I naturen tyder enzootiske sygdomsmønstre på, at virussen kan være latent og kan ryddes i løbet af et år.

Fusion af dirigerede celler (dannelse af syncytium)

En anerkendt træk ved Sendai-virus, deles med medlemmerne af dens slægt, er evnen til at inducere syncytia -dannelse in vivo og in vitro i eukaryote cellekulturer. Dannelsen af ​​syncytium hjælper virussen med at undgå neutralisering af antistoffer fra værtsorganismen under spredning af infektion. Mekanismen for denne proces er temmelig godt forstået og ligner meget den fusionsproces, som virionen anvender for at lette cellulær indtræden. Aktiviteterne for receptorbindende hæmagglutinin - neuraminidase -protein er alene ansvarlig for at inducere tæt interaktion mellem virushylsteret og den cellulære membran.

Det er imidlertid F -proteinet (et af mange membranfusionsproteiner ), der, når det udløses af lokal dehydrering og en konformationsændring i det bundne HN -protein, aktivt indsættes i cellemembranen, hvilket får kuvert og membran til at fusionere, fulgt kort efter virion -indtastning. Når HN- og F -proteinet fremstilles af cellen og udtrykkes på overfladen, kan den samme proces forekomme mellem tilstødende celler, hvilket forårsager omfattende membransmeltning og resulterer i dannelsen af ​​et syncytium.

Denne opførsel af SeV blev udnyttet af Köhler og Milstein, der i 1975 offentliggjorde en artikel om en revolutionerende metode til fremstilling af monoklonale antistoffer . I behov for en pålidelig metode til at producere store mængder af et specifikt antistof fusionerede de to en monoklonal B -celle , udsat for et valgt antigen, og en myelomtumorcelle til at producere hybridomer , der kan dyrkes på ubestemt tid og producere betydelige mængder af en antistof specifikt målrettet mod det valgte antigen. Selvom der siden er fundet mere effektive metoder til at skabe sådanne hybrider, brugte Köhler og Milstein først Sendai -virus til at skabe deres revolutionære celler.

Følsomme cellelinjer og virusstammer

Variabel følsomhed af forskellige cellelinjer for Sendai -virusinfektion

Cellelinjer

Videnskabelige undersøgelser viser, at følgende cellelinjer i varierende grad er modtagelige for SeV -infektion.

Nogle af disse celler (f.eks. LLC MK2, 4647 og HEK 293) udtrykker ikke en protease, der behandler fusionsprotein F0 fra Sendai -virus; derfor producerer de ikke-infektiøse virioner.

Type 1 IFN hæmmer SeV -produktionen i normale humane respiratoriske celler, men undlader at gøre det i humane celler, der stammer fra variable maligniteter som U937 , Namalwa og A549 .

Variable cellekulturer opnået fra tumorer har forskellig følsomhed over for SeV og kan også producere virussen i forskellige mængder. Der er flere faktorer, der er ansvarlige for denne variation. For eksempel blev der observeret en invers korrelation mellem cellers følsomhed over for SeV -infektion og konstitutive mRNA -ekspressionsniveauer af TLR 3 og TLR 7 i primære kulturer af prostatacancer. Således er defekt TLR-aktiveret IFN-signalering en af ​​disse faktorer.

SeV -stamvarianter tilpasset vækst i forskellige celler har forskellige egenskaber. En undersøgelse viser, at SeV-varianten tilpasset vækst i LLC-MK2- celler og SeV-varianten tilpasset vækst i embryonerede æg adskiller sig med to aminosyrer i HN-proteinet . Denne forskel medfører forskellige neuraminidase- konformationer omkring receptor bindingsstedet og variationer i neuraminidase -aktivitet mellem de to virale varianter. En anden undersøgelse viser, at SeV -varianter, der er tilpasset til at vokse i cellekultur 4647 (afrikanske grønne abenyreceller) og i HEK 293 (humane embryonale nyreceller) i stedet for embryonerede hønseæg, også erhverver mutationer i HN -genet, og begge SeV -varianter mistede deres onkolytisk aktivitet.

Stammer

Historie

Alle Sendai -virusstammer tilhører den samme serotype . Oprindelsen af ​​mange stammer af SeV blev beskrevet i 1978. Nogle stammer som Ohita og Hamamatsu blev beskrevet senere. Ohita- og Hamanatsu -stammer blev isoleret fra separate epidemier i laboratoriemus. Ifølge den personlige hukommelse fra Alisa G. Bukrinskaya, der har været medforfatter til mange publikationer relateret til SeV sammen med prof. Viktor M. Zhdanov , begyndende i 1961, blev Moskvas stamme af SeV opnået af prof. Viktor M. Zhdanov fra Ivanovsky Institute of Virology fra Japan i slutningen af ​​1950'erne eller begyndelsen af ​​1960'erne, Det rapporteres, at BB1 -stammen stammer fra Moskva -virusstammen. Stammen BB1 blev givet til forskerne fra Institute of Viral Disease Control and Prevention, Beijing, Kina af forskere fra Ivanovsky Institute of Virology , Moskva, Rusland i 1960'erne.

Virulens

Et felt SeV-isolat, der svækkes gennem ægpassager, er mindre virulent for musens respiratoriske celler. Derfor er de stammer, der blev isoleret fra dyr for et par årtier siden og gennemgik flere passager i æg, mindre virulente for mus i sammenligning med de stammer, der er friske feltisolater.

Defekte interfererende genomer

Defekte interfererende (DI) genomer eller defekte virale genomer (DVG'er) er replikationsdefekte virale RNA -produkter genereret under virusinfektioner af mange typer vira, herunder SeV. En enkelt aminosyresubstitution i et nukleoprotein (NP) forårsager en øget produktionshastighed af DI-genomer i SeV Cantell-stammen, som er kendt for sin særlig stærke induktion af interferon beta (IFN-β) under virusinfektion. Det har vist sig, at DI er ansvarlig for denne stærke IFN-β-induktion.

Stammer oprindelse og sekvens -ID

*Sekvensen af ​​Enders -stammen er tilgængelig fra den amerikanske patentmodificerede Sendai -virusvaccine og billeddannelsesvektor

Stammer sekvens lighed

Virusforberedelse og titrering

Sendai-virus kan produceres ved hjælp af specifikke patogenfrie (SPF) embryonerede hønseæg i overensstemmelse med den etablerede protokol. Der bør udvises forsigtighed ved tilpasning af SeV til vækst i cellekultur til onkolytisk forskning. En forskningsundersøgelse viste, at Sendai -virus, der er tilpasset til at vokse i cellekultur i stedet for hønseæg, mister sin onkolytiske aktivitet.

Sendai-virustiteren kan evalueres ved hjælp af serielt slutpunkt 10x fortyndingsassay af det virusholdige materiale i embryonerede hønseæg. Denne analyse evaluerer den endelige fortynding, der kan forårsage en virusinfektion i 50% af de podede æg. Denne EID50 -analyse bruges til at kvantificere titer for mange vira, der kan dyrkes i æg. En simpel metode til at estimere halvtreds procent slutpunkter. Målingen af ​​virustiter opnået fra dette assay udtrykkes som en embryonisk infektiøs dosis 50% (EID50). SeV titer kan også vurderes ved anvendelse af plaque-analyse i LLC-MK2- celler og ved seriel slutpunkt 2x fortynding hæmagglutineringsassay (HA). HA -testen er imidlertid mindre pålidelig end EID50- eller PFU -testene, fordi den ikke altid indikerer tilstedeværelsen af ​​en levedygtig virus i en prøve. Den døde virus kan demonstrere høje HA -titere.

Tilgængelighed af stammer, konstruktioner, proteiner og antistoffer

Sendai virus forberedelse. for videnskabelig forskning er tilgængelig fra Charles Rivers Laboratory. Det producerede virus er tilgængeligt i flydende eller lyofiliseret form af allontoisk væske eller saccharose -gradient oprenset. [28] Det græske firma Bioinnotech producerer også Sendai Virus til videnskabelig forskning [29] Sendai virus stamme Z frø er tilgængelig fra ATCC, Cantell stamme er tilgængelig fra ATCC, og fra Charles Rivers Laboratory, [30] Moskva stamme er også tilgængelig fra ATCC . Sendai-viruskonstruktion med grønt fluorescerende protein (SeV-GFP4) fås fra ViraTree. [31] Rekombinante SeV-proteiner i E.Coli-ekspressionssystem til videnskabelige undersøgelser, herunder F (aa 26-500), M (aa 1-348), V (aa 1-384), L (aa 1-2228), W ( aa 1-318), N (aa 1-524), C (aa 2-215) og M protein (aa 1-348) er tilgængelige i en form for rekombinant DNA fra Creative Biolabs Vaccine Systemet til omprogrammering af somatiske celler i inducerede pluripotente stamceller er tilgængelig fra ThermoFisher Scientific som CTS ™ CytoTune ™ -iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit, katalognummer: A34546 . Sendai Fluorescence Reporter -system, der gør det muligt at screene celler for at finde dem, der er tilladelige for Sendai -virusinfektion, er tilgængelig fra ThermoFisher Scientific: Katalognummer A16519 . Polyklonale antistoffer mod Sendai -virus afledt af kanin er tilgængelige fra MBL international corporation (kode pd029) og fra Caltag Medsystems (katalognummer PD029) . Polyklonale antistoffer mod Sendai-virus afledt af kylling er tilgængelige fra Abcam (katalognummer ab33988) og fra antistoffer-online.com (nr. ABIN6737444) . Monoklonale antistoffer (IgG1) mod F-protein er tilgængelige fra Kerafast ( katalognummer er EMS015 ) og til HN-protein (Ig2A) antistoffer er også tilgængelige fra Kerafast (katalognummer er EMS016) . Seks forskellige varianter af monoklonale museantistoffer mod HN-protein med forskellige fluoroforer er tilgængelige fra ThermoFisher Scientific med katalognumre Cat #51-6494-82, Cat #25-6494-82, Cat #12-6494-82, Cat #13-6494 -82, kat #14-6494-82, kat #53-6494-82. Standarttesten til Sendai-virus-detektion er ELISA ( enzymbundet immunosorbentassay ), men MFI (Multiplex Fluorescent Immunoassay) er imidlertid mere følsom.

Referencer

Scholia har et emne profil for Murine Respirovirus .