Cellefrit foster -DNA - Cell-free fetal DNA
Cellefri føtalt DNA ( cffDNA ) er føtalt DNA at cirkulerer frit i moderens blod . Moderblod udtages ved venepunktur . Analyse af cffDNA er en metode til ikke-invasiv prænatal diagnose, der ofte bestilles til gravide kvinder i en avanceret moderalder . To timer efter fødslen kan cffDNA ikke længere påvises i moderblod.
Baggrund
cffDNA stammer fra placenta trofoblaster . Foster -DNA fragmenteres, når placentamikropartikler kaster sig ud i moderens blodcirkulation .
cffDNA -fragmenter er ca. 200 basepar (bp) i længden. De er betydeligt mindre end moderens DNA -fragmenter. Forskellen i størrelse gør det muligt at skelne cffDNA fra moderens DNA -fragmenter.
Cirka 11 til 13,4 procent af det cellefrie DNA i moderblod er af føtal oprindelse. Beløbet varierer meget fra den ene gravide til den anden. cffDNA er til stede efter fem til syv ugers svangerskab. Mængden af cffDNA stiger, efterhånden som graviditeten skrider frem. Mængden af cffDNA i moderblod falder hurtigt efter fødslen. To timer efter fødslen kan cffDNA ikke længere påvises i moderblod.
Analyse af cffDNA kan give tidligere diagnose af fostertilstande end nuværende teknikker. Da cffDNA findes i moderblod, medfører prøvetagning ingen forbundet risiko for spontan abort . cffDNA -analyse har de samme etiske og praktiske spørgsmål som andre teknikker såsom fostervandsprøve og chorionisk villusprøveudtagning .
Nogle ulemper ved prøveudtagning af cffDNA omfatter en lav koncentration af cffDNA i moderblod; variation i mængden af cffDNA mellem individer; en høj koncentration af moderens cellefrie DNA sammenlignet med cffDNA i moderblod.
Nye beviser viser, at cffDNA -testfejlfrekvensen er højere, fostrets fraktion (andel af fosteret versus moderens DNA i moderens blodprøve) er lavere og PPV for trisomier 18, 13 og SCA er reduceret i IVF -graviditeter sammenlignet med dem, der spontant opfattes.
Laboratoriemetoder
En række laboratoriemetoder er blevet udviklet til cellefri føtal DNA-screening for genetiske defekter er blevet udviklet. De vigtigste er (1) massivt parallel haglgeværs sekvensering (MPSS), (2) målrettet massiv parallel sekventering (t-MPS) og (3) single nucleotide polymorphism (SNP) baseret tilgang.
En moderlig perifer blodprøve tages ved venesektion ved cirka ti ugers svangerskab.
Adskillelse af cffDNA
Blodplasma adskilles fra moderblodprøven ved hjælp af en laboratoriecentrifuge . CffDNA isoleres og renses derefter. En standardiseret protokol for at gøre dette blev skrevet gennem en evaluering af den videnskabelige litteratur . Det højeste udbytte i cffDNA -ekstraktion blev opnået med "QIAamp DSP Virus Kit".
Tilsætning af formaldehyd til moderblodprøver øger udbyttet af cffDNA. Formaldehyd stabiliserer intakte celler og hæmmer derfor den yderligere frigivelse af moder -DNA. Med tilsætning af formaldehyd varierer procentdelen af cffDNA, der er genvundet fra en moderblodprøve, mellem 0,32 procent og 40 procent med et gennemsnit på 7,7 procent. Uden tilsætning af formaldehyd er den gennemsnitlige procentdel af genvundet cffDNA målt til 20,2 procent. Andre tal varierer dog mellem 5 og 96 procent.
Gendannelse af cffDNA kan være relateret til længden af DNA -fragmenterne. En anden måde at øge fosterets DNA er baseret på den fysiske længde af DNA -fragmenter. Mindre fragmenter kan repræsentere op til halvfjerds procent af det samlede cellefrie DNA i moderens blodprøve.
Analyse af cffDNA
I realtid PCR bruges fluorescerende prober til at overvåge akkumulering af amplikoner . Reporterens fluorescerende signal er proportionalt med antallet af genererede amplikoner. Den mest passende real -time PCR -protokol er designet i henhold til den særlige mutation eller genotype, der skal detekteres. Punktmutationer analyseres med kvalitativ PCR i realtid med brug af allelspecifikke prober. indsættelser og deletioner analyseres ved doseringsmålinger under anvendelse af kvantitativ real -time PCR.
cffDNA kan detekteres ved at finde paternalt nedarvede DNA -sekvenser via polymerasekædereaktion (PCR).
Kvantitativ real-time PCR
kønsbestemmende region Y- gen (SRY) og Y-kromosom kort tandem-gentagelse "DYS14" i cffDNA fra 511 graviditeter blev analyseret ved hjælp af kvantitativ real-time PCR (RT-qPCR). I 401 af 403 graviditeter, hvor moderblod blev udtaget ved syv ugers svangerskab eller mere, blev begge segmenter af DNA fundet.
Indlejret PCR
Anvendelsen af indlejret polymerasekædereaktion (indlejret PCR) blev evalueret for at bestemme køn ved at detektere et Y -kromosomspecifikt signal i cffDNA fra moderplasma. Indlejret PCR påviste 53 ud af 55 mandlige fostre. CffDNA fra plasmaet af 3 ud af 25 kvinder med hunfostre indeholdt det Y-kromosomspecifikke signal. Den følsomhed af nested PCR i dette forsøg var 96 procent. Den specificitet var 88 procent.
Digital PCR
Mikrofluidiske enheder tillader kvantificering af cffDNA-segmenter i moderplasma med nøjagtighed ud over real-time PCR. Punktmutationer , tab af heterozygositet og aneuploidi kan påvises i et enkelt PCR -trin. Digital PCR kan differentiere mellem moderens blodplasma og foster -DNA på en multiplex måde.
Haglgevær sekvensering
Haglgeværs sekvensering med høj kapacitet ved hjælp af værktøjer som Solexa eller Illumina giver cirka 5 millioner sekvensmærker pr. Prøve af moder serum. Aneuploide graviditeter såsom trisomi blev identificeret ved testning i den fjortende uge af drægtigheden. Fostrets hele genomkortlægning ved forældrenes haplotypeanalyse blev afsluttet ved hjælp af sekventering af cffDNA fra moderens serum. Gravide kvinder blev undersøgt ved hjælp af en 2-plex massivt parallel moderplasma DNA-sekventering og trisomi blev diagnosticeret med z-score større end 3. Sekventeringen gav følsomhed på 100 procent, specificitet på 97,9 procent, en positiv forudsigelsesværdi på 96,6 procent og en negativ forudsigelsesværdi på 100 procent.
Massespektrometri
Matrix-assisteret laser desorption / ionisering - time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) kombineret med enkelt-baseforlængelse efter PCR tillader cffDNA påvisning med enkelt base specificitet og enkelt DNA-molekyle følsomhed. DNA forstærkes ved PCR. Derefter er lineær amplifikation med baseforlængelsesreaktion (med en tredje primer) designet til at annealere til området opstrøms for mutationsstedet . En eller to baser sættes til forlængelsesprimeren for at producere to forlængelsesprodukter fra vildtype-DNA og mutant DNA. Enkeltbasespecificitet giver fordele i forhold til hybridiseringsbaserede teknikker ved hjælp af TaqMan- hydrolysesonder. Ved vurderingen af teknikken blev der ikke fundet falske positive eller negative ting, når man ledte efter cffDNA til bestemmelse af fosterkøn i seksten moderplasmaprøver. Køn af enoghalvfems mandlige fostre blev korrekt opdaget ved hjælp af MALDI-TOF massespektrometri. Teknikken havde nøjagtighed, følsomhed og specificitet på over 99 procent.
Epigenetiske ændringer
Forskelle i genaktivering mellem moderens og fosterets DNA kan udnyttes. Epigenetiske modifikationer (arvelige modifikationer, der ændrer genfunktion uden at ændre DNA -sekvens) kan bruges til at detektere cffDNA. Den hypermethylerede RASSF1 A -promotor er en universel føtal markør, der bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af cffDNA. En teknik blev beskrevet, hvor cffDNA blev ekstraheret fra moderplasma og derefter fordøjet med methyleringsfølsomme og ufølsomme restriktionsenzymer . Derefter blev real-time PCR-analyse af RASSF1A, SRY og DYS14 udført. Proceduren afslørede 79 ud af 90 (88 procent) moderblodprøver, hvor hypermethyleret RASSF1A var til stede.
mRNA
mRNA -transkripter fra gener udtrykt i moderkagen kan påvises i moderplasma. I denne procedure centrifugeres plasma, så et vandigt lag vises. Dette lag overføres, og fra det ekstraheres RNA . RT-PCR bruges til at detektere et valgt udtryk for RNA. For eksempel er humant placentalaktogen (hPL) og beta-hCG- mRNA stabilt i moderplasma og kan påvises. (Ng et al. 2002). Dette kan hjælpe med at bekræfte tilstedeværelsen af cffDNA i moderplasma.
Ansøgninger
Prænatal kønsdifferentiering
Analysen af cffDNA fra en prøve af moderplasma muliggør prænatal kønsdiskretion . Anvendelser af prænatal kønsdifferentiering omfatter:
- Sygdomstest : Hvorvidt fostrets køn er en mand eller en kvinde, gør det muligt at bestemme risikoen for en bestemt X-knyttet recessiv genetisk lidelse i en bestemt graviditet, især hvor moderen er en genetisk bærer af lidelsen.
- Forberedelse til alle kønsafhængige aspekter af forældreskab.
- Kønudvælgelse , som efter præimplantation genetisk diagnose kan udføres ved kun at vælge embryoner af det foretrukne køn, eller efter postimplantationsmetoder ved at udføre kønsselektiv abort afhængigt af testresultatet og personlige præferencer.
I sammenligning med obstetrisk ultralyd, der er upålidelig for kønsbestemmelse i første trimester og fostervandsprøve, der medfører en lille risiko for abort , er prøveudtagning af moderplasma til analyse af cffDNA uden risiko. Hovedmålene i cffDNA-analysen er genet, der er ansvarligt for det kønsbestemmende område Y-protein (SRY) på Y-kromosomet og DYS14-sekvensen.
Medfødt adrenal hyperplasi
Ved medfødt adrenal hyperplasi mangler binyrebarken passende corticosteroid syntese, hvilket fører til overskydende adrenal androgener og påvirker kvindelige fostre. Der er en ekstern maskulinisering af kønsorganerne hos hunfostrene. Mødre til fostre i risiko får dexamethason ved 6 ugers svangerskab for at undertrykke hypofysens frigivelse af androgener .
Hvis analyse af cffDNA opnået fra en prøve af moderplasma mangler genetiske markører, der kun findes på Y -kromosomet, tyder det på et hunfoster. Det kan dog også indikere en fejl i selve analysen (et falsk negativt resultat). Faderlige genetiske polymorfier og kønsuafhængige markører kan bruges til at påvise cffDNA. En høj grad af heterozygositet af disse markører skal være til stede for denne applikation.
Faderskabstest
Prænatal DNA -faderskabstest er kommercielt tilgængelig. Testen kan udføres ved ni ugers svangerskab.
Enkeltgenforstyrrelser
Autosomalt dominerende og recessive enkeltgenforstyrrelser, der er blevet diagnosticeret prenatalt ved at analysere paternalt nedarvet DNA, omfatter cystisk fibrose , beta -thalassæmi , seglcelleanæmi , spinal muskelatrofi og myotonisk dystrofi . Prænatal diagnose af enkeltgenforstyrrelser, der skyldes en autosomal recessiv mutation, en maternelt arvet autosomal dominerende mutation eller store sekvensmutationer, der omfatter duplikering, ekspansion eller indsættelse af DNA -sekvenser er vanskeligere.
I cffDNA er fragmenter på 200 - 300 bp længde involveret i enkeltgenforstyrrelser vanskeligere at påvise.
For eksempel er den autosomale dominerende tilstand, achondroplasi forårsaget af FGFR3 -genpunktsmutationen. Ved to graviditeter med et foster med achondroplasi blev der fundet en paternelt nedarvet G1138A -mutation fra cffDNA fra en moderplasmaprøve i den ene og en G1138A de novo -mutation fra den anden.
I undersøgelser af genetikken i Huntingtons chorea ved anvendelse af qRT-PCR af cffDNA fra moderplasmaprøver er CAG-gentagelser blevet påvist på normale niveauer (17, 20 og 24).
cffDNA kan også anvendes til at diagnosticere enkelt gen lidelser . Udviklinger i laboratorieprocesser ved hjælp af cffDNA kan muliggøre prænatal diagnose af aneuploidier som trisomi 21 (Downs syndrom) hos fosteret.
Hæmolytisk sygdom hos foster og nyfødt
Uforenelighed mellem føtal og moderens RhD -antigener er hovedårsagen til den nyfødtes hæmolytiske sygdom . Cirka 15 procent af kaukasiske kvinder, 3 til 5 procent af sorte afrikanske kvinder og mindre end 3 procent af asiatiske kvinder er RhD -negative.
Nøjagtig prænatal diagnose er vigtig, fordi sygdommen kan være dødelig for den nyfødte, og fordi behandling, herunder intramuskulært immunglobulin (Anti-D) eller intravenøst immunglobulin, kan administreres til udsatte mødre.
PCR til påvisning hoejrestyrede (gener) gen exons 5 og 7 fra cffDNA opnået fra maternelt plasma mellem 9 og 13 ugers svangerskab giver en høj grad af specificitet, sensitivitet og diagnostisk nøjagtighed (> 90 procent) sammenlignet med RhD bestemmelse fra nyfødt navlestrengsblod serum . Lignende resultater blev opnået målrettet exons 7 og 10. Dråbe digital PCR i føtal RhD-bestemmelse var sammenlignelig med en rutinemæssig real-time PCR-teknik.
Rutinemæssig bestemmelse af føtal RhD-status fra cffDNA i moderens serum tillader tidlig behandling af risikograviditeter, samtidig med at unødvendig brug af Anti-D reduceres med over 25 procent.
Aneuploidi
- Sexkromosomer
Analyse af maternelt serum cffDNA ved high-throughput sekventering kan detektere fælles føtale sex kromosom aneuploidiseringer såsom Turners syndrom , Klinefelters syndrom og tredobbelt X-syndrom men proceduren er positive prædiktive værdi er lav.
- Trisomi 21
Fostertrisomi af kromosom 21 er årsagen til Downs syndrom. Denne trisomi kan påvises ved analyse af cffDNA fra moderblod ved massivt parallel haglgeværs sekvensering (MPSS). En anden teknik er digital analyse af udvalgte regioner (DANSR). Sådanne test viser en følsomhed på ca. 99% og en specificitet på mere end 99,9%. Derfor kan de ikke betragtes som diagnostiske procedurer, men kan bruges til at bekræfte en positiv maternel screeningstest, såsom en screening i første trimester eller ultralydsmarkører af tilstanden.
- Trisomi 13 og 18
Analyse af cffDNA fra moderplasma med MPSS på udkig efter trisomi 13 eller 18 er mulig
Faktorer, der begrænser følsomhed og specificitet, omfatter niveauerne af cffDNA i moderplasmaet; moderens kromosomer kan have mosaicisme .
En række føtale nukleinsyremolekyler afledt af aneuploide kromosomer kan påvises, herunder SERPINEB2 mRNA, beklædt B, hypomethyleret SERPINB5 fra kromosom 18, placentaspecifikke 4 (PLAC4), hypermetyleret holocarboxylasesyntetase (HLCS) og c21orf105 mRNA fra kromosom 12. Med trisomi, er mRNA -alleler i moderplasma ikke det normale 1: 1 -forhold, men er faktisk 2: 1. Allelforhold bestemt af epigenetiske markører kan også bruges til at detektere de komplette trisomier. Massiv parallel sekventering og digital PCR til føtal aneuploididetektering kan bruges uden begrænsning til fosterspecifikke nukleinsyremolekyler. (MPSS) anslås at have en følsomhed på mellem 96 og 100% og en specificitet mellem 94 og 100% til påvisning af Downs syndrom. Det kan udføres ved 10 ugers svangerskabsalder . En undersøgelse i USA anslog en falsk positiv sats på 0,3% og en positiv forudsigelsesværdi på 80%, når man bruger cffDNA til at opdage Downs syndrom.
Preeklampsi
Preeklampsi er en kompleks tilstand af graviditet, der involverer hypertension og proteinuri normalt efter 20 ugers svangerskab. Det er forbundet med dårlig cytotrofoblastisk invasion af myometrium . Tilstanden begynder mellem 20 og 34 ugers drægtighed, betragtes som "tidlig". Moderplasmaprøver i graviditeter kompliceret af præeklampsi har betydeligt højere niveauer af cffDNA end dem, der er ved normale graviditeter. Dette gælder for tidlig begyndende præeklampsi.
Fremtidige perspektiver
Ny generations sekventering kan bruges til at frembringe en hel genom sekvens fra cffDNA. Dette rejser etiske spørgsmål. Imidlertid kan procedurens anvendelighed stige, efterhånden som der opdages klare forbindelser mellem specifikke genetiske varianter og sygdomstilstande.